171

对PARP抑制剂的评价:对BMG Labtech的Fluostar Omega进行德赢vwin官网客服

丽贝卡·福斯特,凯拉·格里姆肖 Hypoxium有限公司 04/2008
  • 细胞PARP测定和细胞活力测定用于评价PARP抑制剂
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech的Fluostar®欧米茄允许在测定中读出的多功能性,允许快速检测发光,荧光和吸光度

表的内容

介绍

聚ADP-核糖基化是对调节DNA修复中起重要作用的蛋白质的翻译后修饰。聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)将ADP-核糖转移到本身和其他核蛋白质如组蛋白。用于该反应的基材是NAD +。已经证明PARP抑制作用抗癌药物的细胞毒性和电离辐射。因此,很多努力已经进入特定PARP抑制剂的发展。


为了评估这些抑制剂,我们首先使用了特定的PARP活性测定,以监测其抑制结肠癌细胞系中内源性PARP活性的能力。该试验需要蛋白浓度测定(BCA测定-吸光度),然后进行发光检测。


其次,我们使用了AlamarBlue生存力试验(荧光读出)来评估PARP抑制剂增强化疗药物替莫唑胺刺激结肠癌细胞系细胞死亡的作用的能力。所有测量都是使用来自BMG LABTECH的fluosstar Omega多检测微孔板读卡器进行的。德赢vwin官网客服

材料与方法

  • Sigma-Aldrich公司生产的双喹啉酸蛋白检测试剂盒
  • 通用化学发光PARP测定试剂盒,包括来自Trevigen的白板
  • 来自Fisher的清晰和黑色96孔板
  • 来自Sigma-Aldrich的替莫唑胺
  • 来自Invitrogen的艾拉明菊

样本 吸光度560海里
lovos控制 0.767
lovo1nm PARP抑制剂 0.774
lovo3nm PARP抑制剂 0.791
LoVo 10nm PARP抑制剂 0.778
LoVo 30nm PARP抑制剂 0.762
LoVo 100 nM PARP抑制剂 0.75
LoVo 300 nM PARP抑制剂 0.736
空白 0.075

通用化学发光PARP测定
在收获细胞并在PARP缓冲液中裂解细胞并在PARP缓冲液中裂解1小时,用PARP抑制剂处理LOVO细胞。


BCA蛋白检测在96孔微孔板中进行,按照制造商适用于96孔板的说明进行。使用氟星欧米茄在560nm读取板。


为BCA蛋白分析生成了一条标准曲线(图1),从这条曲线中测定裂解液的蛋白浓度,并将每个样品的蛋白浓度调整到40 μg。

然后筛选裂解物以筛选制造商的用于确定细胞和组织提取物中PARP活性的指令的PARP活性。


该实验以96孔的条带形式测量生物素化聚ADPribose在组蛋白上的掺入。使用链霉亲和素辣根过氧化物酶(HRP)偶联物进行检测。加入辣根过氧化物酶(HRP)衬底后,使用配备发光光学设备的荧光Omega读取产生的发光信号。


阿拉马斯博林能力测定
将LoVo细胞接种于96孔黑色板中,每孔5000个细胞,并让其粘附过夜,然后加入化合物或载体控制。


向细胞中加入0-300μm替莫唑胺,用和没有300nm PARP抑制剂72小时。然后将10%(v / v)加入细胞中,并在37℃下孵育6小时。活性,代谢活性细胞将阿拉马汞底物转换为荧光产物,然后使用FluoStarω(激发544nm和emisson 590nm)检测该荧光产物。

结果与讨论

通用化学发光PARP测定
在发光测量之后,使用GraphPad Prism分析数据(图2)。PARP抑制剂在14 nM浓度下抑制50%的PARP活性。

Alamarblue增殖试验
在测量荧光产品之后,使用GraphPad Prism分析数据(图3)。Temo-Zolomide作为单一的药剂导致非常小的细胞死亡,用IC50> 300μM。


然而,PARP抑制剂与替莫唑胺联合使用,导致细胞死亡显著增加,导致IC5060微米。这表示> 5倍的细胞死亡增强。

注意:单独的PARP抑制剂不会刺激细胞死亡。

结论

Flyostar Omega测量吸光度,发光和荧光的能力,有助于使用单个机器简单,快速测量我们评估的所有方面。

去前