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外泌体标记物检测:一种灵敏的铕时间分辨免疫荧光法

Laur-Alexandru Botos(1)Manoja Rasamanikkam(2) (2) BMG实验室,英国Aylesbury德赢vwin官网客服 07/2019
  • 检测外来标记的不同表达水平
  • 方法简单,重复性高
  • 高度敏感和特异性:只有抗原显示在多个副本是可检测的

表的内容

介绍

外泌体是内体源的细胞外囊(EVS)。这些囊泡含有蛋白质,脂质和核酸,并促进生物体内不同细胞类型之间的细胞间连通。快速扩展的EV从检测到外来的工具和其内容的工具迅速扩展。具有露出结构域的Tetraspanin蛋白如CD9,CD63和CD81,特别是在外渗膜中富集,并且通常用作外泌体生物标志物。这些肘花素在不同细胞类型中表现出对外泌体的普遍性的普遍性。已经制定了来自细胞引导系统的时间分辨的免疫FL呼吸(TRIFF™)外出检测试剂盒,用于分析外泌体表面的这些四胞苷蛋白的水平。


特异性™外出检测试剂盒使研究人员能够直接测量来自细胞培养基,尿液或血液等来源的外来肌肉中存在的四菌素,具有低背景信号和高灵敏度。使用非常敏感的时间分辨荧光(TRF)板读数器可确保最佳测定性能。该试剂盒已经在弗洛斯塔·欧米茄,Clariostar评估+和本百合点FSX所有仪器均满足试剂盒的灵敏度要求。

测定原理

步骤1:生物素化抗体与链霉亲和素包被的试验板结合。该试剂盒提供了一个具有8孔条带格式的96孔微孔板。


步骤2:添加生物样品。外泌体和任何游离抗原都被抗体捕获。


第3步:加入铕(Eu)标记抗体(与步骤1中使用的抗体相同),并与目标外泌体抗原特异性结合。任何结合单体的表位都已被占据而未被发现。样品然后读取时间分辨荧光(TRF)板阅读器,如pherstarFSX

材料与方法

  • TRIFic™外泌体检测试剂盒(细胞引导系统)
  • EXO-Spin™外科纯纯化套件(细胞引导系统)
  • 链霉亲和素涂膜96孔微孔板(包括细胞引导系统试剂盒)
  • TRF微孔板阅读器- pherstarFSX(德赢vwin官网客服BMG LABTECH)

外来体样品制备
25µg外泌体使用Exo-spin™外泌体纯化试剂盒从条件细胞培养基中纯化。采用Bradford法测定蛋白质含量。取100µg/ml至0.8µg/ml PBS按0.5倍倍数连续稀释,共获得8种不同的外泌体浓度。


TRIFic™协议
将100µl新鲜稀释的生物素结合抗体(2 ng/µl)加入链霉亲和素涂层板的每孔中。随后,使用下面描述的方案进行孵育和清洗。将100µl每种外泌体稀释液(通过如上所述的系列稀释制备)转移到每孔中。空白取100µl PBS。样品孵育后再次洗涤,如下所述。将100µl新鲜稀释的eu标记抗体(0.25 ng/µl)加入链霉亲和素涂层板的每孔中。样品孵育后再次洗涤,如下所述。每孔加入100µl铕荧光增强剂溶液。平板在室温下(RT)培养15分钟,平板振动筛750 RPM。然后使用后机匣兼容的微孔板阅读器(PHERAstar)测量后机匣FSX)。


孵育和清洗规程
将板在室温下在750rpm的板式振荡器上温育1小时。使用250μL洗涤缓冲液洗涤每个板3次,用于每个洗涤循环。除去剩余的洗涤缓冲液。

仪器的设置

视镜设置 时间分辨荧光(TRF)
过滤器:

刺激:337 nm

排放:615海里

通用设置 闪光的数量: 200带闪光灯
解决时间: 0.3秒
集成开始: 200µ年代
集成时间: 400µ年代

结果与讨论

Exo-spin™从条件细胞培养基中分离出的外泌体样品使用TRIFic™分析。CD9、CD63和CD81(常用的表面外泌体标记物)的表达,在来自两种不同癌细胞系的外泌体上进行测量。下面的数据是使用PHERAstar获得的FSX,然而,所有三种BMG LABTECH仪德赢vwin官网客服器都超过了检测所需的性能标准。

图2中的每个数据点的误差条。参照图2和图2. 3显示了信号的非常小的方差,对于某些数据点来说是不受欢证的。这展示了Trictific™套件和Pherastar一起提供的伟大一致性和再现性FSX。此外,每个连续稀释的R2值都显示出优异的线性度,这与总蛋白质浓度的数据一致。

图4和图5所示的数据进一步证明了通过试验产生的后机匣信号在宽强度范围内的一致性。


结论

trife™检测已成功使用,与BMG LABTECH平板阅读器。德赢vwin官网客服他们为不同的外泌体标记物获得了准确可靠的TRF信号。在一个大范围的外泌体浓度范围内,信号的巨大线性和一致性证明了该检测在一个大动态范围内生成有用数据点的稳健性。这种高灵敏度的检测方法也可以用于未纯化的样品。


参考文献

1.Marina Colombo等人。为基础。Rev. Cell Dev. Biol。30(2014): 255 - 89。DOI: 10.1146 / annurev - cellbio - 101512 - 122326
2.Diedrik Duijvesz等人。国际癌症杂志(2015)137:2869-78。DOI: 10.1002 / ijc.29664
3.www.cellgs.com

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