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外来标记检测:一个精致的敏感铕时间分辨免疫荧光测定

lauren - alexandru Botos (1) Manoja Rasamanikkam (2) (1)细胞引导系统,剑桥,英国(2)BMG Labtech,英国艾尔斯伯里德赢vwin官网客服 07/2019
  • 检测外泌体标记物的不同表达水平
  • 简单的测定提供高度的再现性
  • 高度敏感和规格:只有多个副本显示的抗原是可检测的

介绍

外泌体是起源于内吞体的细胞外囊泡。这些小泡包含蛋白质、脂质和核酸,并促进生物体内不同细胞类型之间的细胞间通信。EV研究领域的快速发展极大地得益于外泌体及其含量的检测工具。带有暴露域的Tetraspanin蛋白如CD9、CD63和CD81在外泌体膜中特别富集,经常用作外泌体生物标记物。这些四酯酶在不同细胞类型的外泌体上显示出一种独特的流行模式。来自Cell Guidance Systems的时间分辨免疫荧光(TRIFic™)外泌体检测试剂盒已被开发出来,专门用于分析外泌体表面的四磷酸腺苷蛋白水平。


TRIFic™外泌体检测试剂盒使研究人员能够直接测量来自细胞培养基、尿液或血液等来源的外泌体上的tetraspanin,具有低背景信号和高灵敏度。使用非常敏感的时间分辨荧光(TRF)平板阅读器确保最佳的检测性能。该试剂盒已经在FLUOstar Omega, CLARIOstar上进行了评估和PHERAstarFSX.所有仪器满足试剂盒的灵敏度要求。

测定原则

步骤1:生物素化抗体与链霉亲和素包被的检测板结合。试剂盒提供96孔微孔板,8孔条带格式。


第2步:加入生物样品。外肌肉和任何游离抗原被抗体捕获。


步骤3:加入铕(Eu) - 标记的抗体(与步骤1中使用的抗体相同)并结合,以靶向靶外抗原。任何束缚单体的表位已经占用而未检测到。然后在诸如Pherastar的时间分辨荧光(TRF)板读数上读取样品FSX.

材料与方法

  • 特异性™外科检测试剂盒(细胞引导系统)
  • 外泌体纯化试剂盒(细胞导向系统)
  • 链霉亲和素包被96孔微孔板(包括细胞导向系统试剂盒)
  • TRF microplate读卡器 - PherastarFSX.(德赢vwin官网客服BMG Labtech)

外出样品制备
使用EXO-Spin TM外出纯化试剂盒从调理细胞培养基中纯化25μg外泌体。通过Bradford测定法测定蛋白质量。PBS中的连续稀释率为0.5的100μg/ ml至0.8μg/ ml,得到总共8种不同的外出组浓度。


TRIFF™协议
向链霉抗胎蛋白涂覆板的每个孔中加入100μl新鲜稀释的生物素 - 共轭抗体(2ng /μl)。随后,进行使用下述方案的孵育和洗涤。将100μl每种外出稀释(通过如上所述通过连续稀释制备)转移到每个孔中。用100μlPBS用作坯料。如下所述孵育样品并再次洗涤。然后将100μL新鲜稀释的Eu标记的抗体(0.25ng /μl)加入到链霉蛋白涂覆板的每个孔中。如下所述孵育样品并再次洗涤。然后向每个孔中加入100μl荧光荧光凸溶液。在750rpm的板式振荡器上在室温(RT)下将板在室温(RT)中温育15分钟。然后使用TRF兼容的微孔板读取器(Pherastar)测量TRFFSX.)。


孵化和清洗方案
平板在RT下以750 RPM的摇板机上孵育1小时。每个洗盘用250µl的水洗缓冲液清洗3次。去除剩余的洗涤缓冲液。

仪器设置

光学设置 时间分辨荧光(TRF)
过滤器:

激励:337海里

排放:615海里

一般设置 闪光次数: 200带闪光灯
解决时间: 0.3秒
集成开始: 200μs.
积分时间: 400μs.

成绩与讨论

使用Trictific™测定分析来自条件细胞培养基的exo-Spin™分离出的外出样品。测量CD9,CD63和CD81(常用表面外出标记)的表达,以衍生自两种不同癌细胞系的外索体。使用Pherastar获得以下数据FSX.然而,所有三个BMG Labtech仪器德赢vwin官网客服都超过了测定所需的绩效标准。

图2和图3中每个数据点的误差条显示了一个非常小的信号变化,对于一些数据点不明显。这证明了TRIFic™试剂盒和PHERAstar的一致性和重现性FSX.。此外,每个序列稀释的R2值都表现出良好的线性关系,这与总蛋白浓度的数据一致。

所示的数据在图4和图4中。图5进一步展示了测定在宽强度范围内产生的TRF信号的一致性。


结论

TRIFF™测定成功地使用,与BMG LABTECH板读卡器一起使用。德赢vwin官网客服它们获得了不同外出标记的准确且可靠的TRF信号。在宽范围的外外浓度上的信号的巨大线性和一致性展示了测定在宽动态范围内产生有用的数据点的稳健性。该高敏感的测定也可以与未填充样品一起使用。


参考

1.Marina Colombo等人。为基础。Rev. Cell Dev. Biol。30(2014): 255 - 89。DOI: 10.1146 / annurev - cellbio - 101512 - 122326
2. Diedrik duijvesz等。int。J.癌症(2015)137:2869-78。DOI:10.1002 / IJC.29664
3.www.cellgs.com.

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