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稳定的绿色荧光蛋白突变体在B组链球菌中的表达。增长,检测和监测,用克拉克罗斯塔

Matthew J. Sullivan Glen C. Ulett 澳大利亚格里菲斯大学昆士兰医学科学学院和孟希斯卫生研究所 12/2018
  • 新的重组质粒pGU2664在GBS中稳定表达高荧光的GFPmut3生物标记物
  • GFPMUT3生物标志物可以成功地应用以跟踪液体介质中细菌的生长
  • Clariostar.®获得了吸光度、荧光和偏振荧光来表征gfpmut3gbs

介绍

链球菌agalactiae(也称为B组链球菌[GBS])与人类和动物的各种疾病和感染有关。1这些包括新生儿疾病,败血症,关节炎,肺炎,脑膜炎,皮肤和软组织感染,如尿路感染。


专注于宿主定植和毒力机制的研究效果主要利用与流荧光生物标志物联系的显微镜技术。迄今为止,迄今为止,标记GBS的GBS的策略仅限于基于抗体的免疫染色方法和非培养物蛋白/ DNA污渍。


绿色荧光蛋白(GFP)表达是对细菌研究的常用标记方法。它使得能够在复杂样品中的识别细菌,对真核宿主细胞的细菌亚细胞的监测以及新的和EFIE枚举方法的发育,例如基于流动的细胞测定法。

在最近的一项研究中1我们报道了一种绿色荧光蛋白突变体(GFPmut3)在GBS中稳定表达。这是通过使用gfp变异表达质粒pGU2664实现的。GFPmut3的荧光强度比GFP高20倍,使GBS可视化的灵敏度更高2。在此,我们描述了旨在验证和监测GBS培养物中GFPMUT3表达的稳定性的吸光度,流浊和流晶偏振强度实验。微观分析的详细说明,抗微生物对GB中GFPMUT3表达的影响,应用和环境微生物学描述了GBS表达GBS与人上皮细胞的GFP表达研究1


测定原则

偏振光荧光强度
荧光偏振测量溶液中分子的旋转。高分子量物种(如GFP)旋转缓慢,当被平面偏振光激发时,向探测器发射高比例的偏振光。低分子量化合物旋转速度快,并重新发射非偏振光。极化程度(P)定义为(Ipar- 一世) / (一世par+ I.),我par是平行测量的流动荧光强度和i是垂直于激发光的偏振面所测得的。


对于溶液中缓慢旋转的物种,极化值可高达0.4 (400mP)。对于低分子量,快速旋转的分子,这个值非常低(35mP或更少),因为Ipar-一世由于具有非常接近的强度,在上面的等式中提供了非常小的值。在我们的研究中,我们已经利用了这种财产来监测GFPMut3流域在常用的细菌培养基中的背景自动流荧光,用于GBS,TODD-Hewitt汤(THB)的生长。极化强度,我par和我,在时间上测量在12小时内,通过总和计算总流动差异极化强度par+ 2i


材料与方法

  • 微孔板(96孔,Greiner Cat No. 655185)
  • Clariostar与大气控制单元(ACU)
  • 使用透气呼吸呼吸膜(Sigma,Cat No.Z380059)密封板

实验程序
隔夜收集GBS str 874391的THB培养物,离心(8000 x g, 10分钟),用PBS (pH 7.4)洗涤3次。随后将细菌以1:100的比例稀释到新鲜的化学定义培养基(CDM)或THB中。1 x106每孔的CFU)和200μl的细胞悬浮液中的三种细胞悬浮液中的三份分为96孔板的孔等。


用呼吸易膜密封板,在Clariostar中孵育12小时多模标,温度设置为37°C和5%的CO2大气层。


在600nm处的吸光度(OD600),荧光强度和/或极化荧光强度同时监测每15分钟,搅拌在300 rpm的周期之间。

仪器设置

视镜设置 吸光度
离散波长 600 nm.
pathlength校正 200μl.
荧光强度
LVF. 470 - 15
汽车488.8
515 - 20
获得 1700
荧光偏振(FP)
过滤器 前482 - 16
LP504
EM 515-30.
目标像素 35
收益 答:951;B 1113
一般设置 数量的闪光 FP的10,50
建立时间 0.2 S.
平均轨道 3毫米
动力学设置 数量的周期 74
周期时间 900秒
孵化 37°C
大气控制 有限公司2: 5%;O2:监控

成绩与讨论

通过电穿孔将GFPMUT3质粒PGU2664引入GBS 874391以产生GBS菌株GU2666(GFP +)。另外,引入了非GFPMUT3载体以产生菌株GU2672(GFP-)。1

表明携带pGU2664质粒的GBS菌株没有显著的代谢负担(图1A)。此外,有较强的GFP发射,与细胞密度密切相关,表明GFPmut3在指数生长期和平稳生长期的表达和稳定性(图1B)。


在固定相和低营养条件下也检测了GFPmut3的荧光。细胞培养过夜,重新悬浮在PBS中,监测浑浊度和荧光超过12h,如上所述。在浑浊度保持稳定的情况下,我们观察到这些固定相群体稳定且高水平的荧光(图1,C和d)。


THB是一种标准的完整培养基,通常用于生长动物或基于动物或细胞培养的方法中的感染实验的GBS。因此,我们还研究了THB生长期间GFPMUT3 FOREOR的表达。有趣的是,THB介质含有在515nm处自动流动的化合物,其干扰GFP信号(图2B)。通过12小时(图2c)通过偏振流动荧光强度使GBS生长蒙特GBS生长可以方便地克服。

结论

综上所述,上述结果为在实验系统中分析表达GFPmut3的GBS提供了一种新的方法,强调了FP强度监测技术在微生物学中的实用性。


本研究还强调了CLARIOstar多模式platereader与ACU的多功能性。该仪器可以在可控气氛(CO2和/或O2),同时使用各种技术(Fl, Lum, Abs, FP)获取数据。在我们的实验室里,这已经成为研究细菌生存和感染机制的重要工具。


参考资料

1. Sullivan,MJ,Ulett,GC。应用环境微生物学。(2018)84:1-18。DOI:10.1128 / AEM.01262-18。
2.Cormack BP等。Gene(1996) 173: 33-38。版权所有©美国微生物学会,应用与环境微生物学,84 (18),2018,e01262-18

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