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更快的Pyrogene™检测内毒素使用Clariostar Plus上的增强动态范围

Carl Peters(1)Caitlin East(2)Josiah Hosie(2) (1)B德赢vwin官网客服MG Labtech,Cary,NC(2)Lonza,Walkersville,MD 01/2020
  • 内毒素检测对于需要用纯化的核酸或蛋白质进行治疗的应用是至关重要的
  • 具有Pyrogene™的荧光强度检测是比基于LAL的检测更可持续的选择
  • Clariostar上的增强动态范围(EDR)允许快速,准确的检测焦基因™测试

介绍

内毒素检测仍然是研究和治疗的极其重要的方面,这些观点来自革兰氏阴性细菌中的表达1。由于在制备,检测和随后消除内毒素中可以源于少量内毒素的显着的消极反应是至关重要的。


检测内毒素最常用的方法是鲎试剂(LAL)法。鲎血细胞是从鲎的血液中提取的。虽然要小心翼翼地提取这种试剂并将螃蟹安全地放回海洋,但这种方法的长期可行性值得怀疑。的PyroGeneTM方法,基于重组因子C (rFC),消除了需要马蹄蟹血。


新的Clariostar的一个功能之一是增强的动态范围(EDR)能力。EDR允许您在同一平板上检测非常高和低的信号,简化了分析设置,特别是动力学分析。用动力学方法和EDR方法收集数据,我们发现了焦性基因TM可能以等效的敏感性检测到荧光测定作为标准聚戈涅戈TM协议在更短的时间内,尽快作为QCL-1000TM(LAL)协议。

测定原则

因子c是一种蛋白酶,其正常功能是用作血管凝固级联在暴露于脂多糖如内毒素时的引发剂2。其天然基质是因子B,并且对因子B中的裂解部位的知识已经使得能够产生可以检测到的基材体外测定。


图1显示了原理上的PyroGeneTM测定是基于的。内毒素对RFC的结合导致酶的活性形式。然后,这可以切割一种流量源性底物,释放可检测的流动性。

材料与方法

  • 黑色,96孔,透明底,非热生微板(康宁)
  • CLARIOstar(德赢vwin官网客服BMG LABTECH)
  • PyroGeneTM重组因子C终点检测
  • 内毒素无吸管尖端和管(LONZA)

实验程序
如套件指令中所述创建20IU / ML标准。类似地,通过稀释20IU / mL标准将浓度从10 IU稀释至0.0005 IU / mL来制备所示浓度的标准。将每种标准(n = 5)的重复,并将热原水坯料(n = 12)的重复以100μl的体积加入微孔板中。在37℃下将微孔板预孵育至少10分钟,之后加入100μL如试剂盒指令中所示制备的检测试剂混合物。在ClarioStar上读取板中产生的流动荧光如下:


仪器设置

光学设置 荧光强度,板模式动力学
单色仪的设置
励磁 371-15
二向色 自动407.8.
排放 447-20.
获得通过 edr.
焦点 自动对焦(7mm)
一般设置 建立时间 0.5秒
孵化 37°C
动力学 数量的周期 13
周期 300秒
闪光数量 20.

成绩与讨论

典型的聚会TM测试立即采用初始读数(t=0),然后在1小时孵育后进行第二次读数。t=0读数提供了可以从孵化结果中减去的基线。我们试图发现在CLARIOstar上使用EDR可以多快地区分不同浓度的内毒素。为此,我们在通常1小时的时间里每隔5分钟阅读盘子。本实验的结果,如图2所示,表明较高浓度的内毒素显示出强劲的荧光增加,在短短10分钟内,EDR允许一个非常宽的荧光强度范围在一个平板上检测。

由于这一事实,典型的刻度有时可以模糊相对较小的信号变化。图3显示了Pyrogene的响应是正确的TM测试。对于所用的2个最低浓度的内毒素,可以看到显着的较低强度信号变化。

对PyroGene的检测结果进行分析TM测试数据的日志日志转换用于启用未知的预测。图4是我们的结果,并比较了在15,20和60分钟下该变换下的数据的线性文件。数据在该变换的文件中符合良好,r2值为1,显示所有时间。

接下来,我们试图确定实验的重复性,特别是在早期时间点。为此,重复采用该方法获得4个重复试验。表1中的结果提供了这些实验的%CV范围。15分钟和20分钟时的%CV与60分钟时的可变性相当,当然在LONZA本试验的可变性规范范围内。


表1 Pyrogene™测定的变异性比较

计算%CV用于测定复制(n = 4)表示在短至15分钟内的可接受性能。

%CV范围在时间(分钟)
[内毒素] 15 20. 60
.005 IU 3.4-19.3. 3.5-14.1. 6.5-14.4
.05 IU 4.5-23.7 3.1-24 4.3-13.8.
.5 IU 7-21 5.8-18.8. 4.3-14.9
5 IU. 7.7-20.9 5.9-19 3-11.9
10 IU 3.2 - -18.4 2.7-16.3. 2.4-7.5

结论

Clariostar的EDR功能使敏感检测变得容易。在这里,我们展示了如何是有利的,允许聚会TM从Lonza测定,在短短15分钟内进行,而不会损失灵敏度。*


参考

1.苏,W.&Ding,X.(2015)。J. Lab。汽车。20:354-364。DOI:10.1177 / 2211068215572136
2.Muta, T.,等(1991)。化学。266:6654 - 6661
3. DAS,A.P.,等。(2014)Biosens。生物电形51:62-75。DOI:10.1016 / J.BIOS.2013.07.020

*注意:在Pyrogene™RFC测定包装插入件中的测定指令之外进行对本研究进行的测试。LONZA不保证在产品说明中未明确说明的任何测试程序或测定性能规范的性能。最终用户负责将任何偏差验证到产品包插入件中概述的程序。

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