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更快的Pyrogene™检测内毒素使用Clariostar Plus上的增强动态范围

Carl Peters(1)Caitlin East(2)Josiah Hosie(2) (1) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH, Cary, NC (2) LONZA, Walkersville, MD 01/2020
  • 内毒素检测对于需要用纯化的核酸或蛋白质进行治疗的应用是至关重要的
  • 与基于lal的检测相比,使用PyroGene™荧光强度检测是一个更可持续的选择
  • Clariostar上的增强动态范围(EDR)允许快速、准确地检测PyroGene™测试

介绍

内毒素检测仍然是研究和治疗的极其重要的方面,这些方面来自革兰氏阴性细菌中的表达1。由于制剂中即使是少量的内毒素也会引起显著的阴性反应,因此内毒素的检测和随后的清除是至关重要的。


最常用的内毒素检测方法是各种鲎试剂(LAL)检测方法。鲎的阿米巴细胞是从马蹄蟹的血液中获得的。尽管人们非常小心地提取这种试剂,并将蟹安全地送回海洋,但这种方法的长期可行性值得怀疑。的PyroGeneTM方法:基于重组因子C (rFC),不需要马蹄蟹血。


新的Clariostar的一个功能之一是增强的动态范围(EDR)能力。EDR允许您在同一平板上检测非常高和低的信号,并简化分析设置,特别是动力学分析。用动力学方法收集数据,利用EDR,我们发现热原TM可能以等效的敏感性检测到荧光测定作为标准聚戈涅戈TM协议在更少的时间,快速的QCL-1000TM (LAL)协议。

测定原则

因子c是一种蛋白酶,其正常功能是用作血管凝固级联在暴露于脂多糖如内毒素时的引发剂2。其天然基质是因子B,并且对因子B中的裂解部位的知识已经使得能够产生可以检测到的基材体外测定。


图1显示了热原的原理TM测定是基于的。内毒素对RFC的结合导致酶的活性形式。然后,这可以切割一种流量源性底物,释放可检测的流动性。

材料与方法

  • 黑色,96孔,透明底,无热原微孔板(康宁)
  • CLARIOstar(德赢vwin官网客服BMG LABTECH)
  • PyroGeneTM重组因子C终点测定(LONZA)
  • 内毒素无吸管尖端和管(LONZA)

实验的程序
按照试剂盒说明书创建20 IU/mL标准品。类似地,标准的指示浓度是通过稀释20 IU/mL标准跨度浓度从10 IU到0.0005 IU/mL。将每个标准品的重复(n=5)和无热原水空白的重复(n=12)添加到体积为100µl的微孔板中。37℃预孵育至少10分钟后,加入试剂盒说明书中规定的100µl检测试剂混合物。在克拉罗星上可以看到板上产生的荧光如下:


仪器设置

光学设置 荧光强度,板模式动力学
单色仪的设置
励磁 371-15
二向色 自动407.8.
排放 447-20.
获得通过 edr.
焦的高度 自动对焦(7毫米)
一般设置 建立时间 0.5秒
孵化 37°C
动力学 数量的周期 13
周期 300秒
数量的闪光 20.

成绩与讨论

典型的PyroGeneTM测试采用立即初始读数(t=0),然后在孵育1小时后进行第二次读数。t=0的读数提供了可以从孵化结果中减去的基线。我们试图发现使用克拉罗星上的EDR能多快区分不同浓度的内毒素。为此,我们在通常的1个小时的过程中,每隔5分钟阅读一次车牌。实验结果如图2所示,较高浓度的内毒素表现出荧光强度的强劲增加,在短短10分钟内就可检测到。EDR允许在单个平板上检测到非常大范围的荧光强度。

由于这一事实,典型的刻度有时可以模糊相对较小的信号变化。图3显示了Pyrogene的响应是正确的TM测试。值得注意的是,较低的信号强度变化可以看到两种最低浓度的内毒素使用。

分析热原的结果TM测试数据的日志日志转换用于启用未知的预测。图4是我们的结果,并比较了在15,20和60分钟下该变换下的数据的线性文件。数据在该变换的文件中符合良好,r2值为1,显示所有时间。

接下来,我们试图确定测定的重复性,特别是在早期的时间点。为此,重复上述方法以获得4个测定重复。表1所示的结果提供了这些实验的%CV范围。在15分钟和20分钟时的%CV与60分钟时的可比性相当,并且肯定在龙沙的可比性规格之内。


表1 PyroGene™分析的可变性比较

计算%CV用于测定复制(n = 4)表示在短至15分钟内的可接受性能。

%CV范围在时间(分钟)
(内毒素) 15 20. 60.
.005 IU 3.4 - -19.3 3.5-14.1. 6.5-14.4
. 05 IU 4.5-23.7 3.1-24 4.3-13.8.
5国际单位 7-21 5.8-18.8. 4.3-14.9
5 IU 7.7-20.9 5.9-19 3 - 11.9
10个单位 3.2 - -18.4 2.7 - -16.3 2.4 - -7.5

结论

Clariostar的EDR功能使敏感检测变得容易。在这里,我们展示了如何是有利的,允许聚会TM从Lonza测定,在短短15分钟内进行,而不会损失灵敏度。*


参考资料

1.苏,W.&Ding,X.(2015)。J. Lab。汽车。20:354-364。DOI:10.1177 / 2211068215572136
2.Muta, T.等(1991)J. Biol。化学。266:6654 - 6661
3. DAS,A.P.,等。(2014)Biosens。生物电形51:62-75。DOI:10.1016 / J.BIOS.2013.07.020

*注意:本研究的检测在PyroGene™rFC检测试剂盒说明书中定义的检测说明之外进行。龙沙不保证产品说明书中未明确说明的任何测试程序或化验性能规范的性能。最终用户有责任确认任何与产品说明书中所列程序的偏差。

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