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使用Flyostar Omega酶读卡器实时遵循Abeta原纤化/聚集

弗兰克鲍曼 Hertie临床脑卒中研究所 12/2014
  • 用于监测Aβ聚集的微孔板读卡器的长期摇动能力
  • 来自信号曲线的延迟时间被证明是用于原纤化过程的有用措施

介绍

淀粉样蛋白-β(Aß)肽的聚集是阿尔茨海默病的基本霍尔标记。细胞外老年斑块的形成将导致临床患者中的突触和神经元损伤。Aβ肽的聚集过程被视为种子驱动。这些种子由β的小稳定aggegrates组成。据认为,即使在患者经历任何症状之前,这些聚集体也存在于阿尔茨海默氏症的早期阶段。如果这是真的,则确定这些早期聚集体(聚集种子)是一个优秀的诊断工具。


在这里,我们提出了一种无细胞的测定(Frank-Assay =重组Aβ核酸的纤维化),其允许测定来自脑组织匀浆的聚集种子量。使用FlyoStar,测定率超过2-3天®BMG Labtech Omega酶标读卡器。德赢vwin官网客服


测定原则

测定使用硫蛋白T遵循淀粉样蛋白形成(图1)。硫蛋白T是苯并噻唑盐,其已知在与β-富含β-富含β-β的结构结合时显示出增加的荧光,例如β1的淀粉样蛋白原纤维。

在聚集或原纤化之前可以开始临界量的初始聚集种子,需要存在或自发地形成。即使在过量的单体Aβ存在下,这也是一种热力学不自样的过程,动力学慢,并且在可测量的聚集开始之前延迟时间慢。一旦通过掺入新形成的原纤维,可以通过掺入新形成的原纤维的荧光的增加来监测足够的种子形成了巨大且陡峭的原纤维化的增加。经过一段时间后,达到了表明反应结束的平台。延迟时间很大,可以通过聚集种子的外源添加来缩短。这些种子与它们的量加速荧光增加。


材料与方法

  • Fluostar omega,B德赢vwin官网客服MG Labtech,德国
  • 黑色,清澈的底部96孔板,Greiner
  • 密封膜,非无菌,Excel Scientific

所有其他化学物质都是通过正态分布通道购买的。


供体脑组织和提取物制剂
APP23转基因(TG)小鼠用作所有研究的种子供体。该转基因小鼠模型的特征在于突变人类应用的过度表达。转基因APP(淀粉样蛋白前体蛋白)受蛋白水解裂解,产生β-淀粉样肽,其又是聚集的,并且导致由β-淀粉样沉积物组成的淀粉样蛋白斑块。


供体脑组织从APP23 Tg小鼠中获得以及非Tg野生型(WT)小鼠获得。去除后,大脑被分成半球。一个半球立即在干冰中立即新鲜冷冻(但未固定),而另一种半球在甲醛溶液中浸没固定。完成固定过程后,将该半球在干冰中冷冻并储存在-80°C直至使用(图2)。

在使用之前,固定和新鲜冷冻组织均匀化,离心并等离上清液。对于所有实验,使用10%(w / v)提取物。


硫蛋白T聚合测定
在37℃下在聚集缓冲液(50mM磷酸盐和150mM NaCl)中,在聚集缓冲液(50mM磷酸盐和150mM NaCl)中,将蛋白酶抑制剂鸡尾酒(完整,罗氏),20μm硫代蛋白T,25μMAβ1-40的脑提取物(完整,罗氏),25μmβ1-40孵育。每个脑匀浆中存在8个复制孔。从井底每30分钟测量荧光增加。在每次测量之前,将微孔板摇动(双轨道模式)以500rpm摇动30秒。在当前状态窗口中遵循测量的进展,并且在所有样品显示平台后停止反应。遥控器(TeamViewer)用于监控并最终在周末停止测量。原始数据安装并使用BMG LabTech的火星数据分析软件或GraphPad Prism确定滞后时间。德赢vwin官网客服

仪器设置

检测模式: 荧光强度,板模式
视镜: 底光学
轨道平均: 活化,直径为4毫米
过滤器: 440-10 / 480-10
周期数: 90.
周期: 1800秒
闪光数量: 10.
温度: 37℃

成绩与讨论

随着时间的推移信号曲线的典型结果如图3所示:

所有信号曲线显示一定时间后荧光显然。这种增加说明硫蛋白T掺入新形成的AB原纤维中。在一段时间后,达到了一个高原,被认为是淀粉样蛋白形成和硫蛋白T掺入过程的终点。


信号开始增加的时间是滞后时间。MARS数据分析软件提供了创建计算滞后时间的信号曲线的4参数适合的可能性(滞后时间对应于拟合的EC20值)。形成初始原纤维种子直至达到滞后时间。考虑到这一点,滞后时间可以用作比较不同脑匀浆的措施(图4)。

从图4可以遵循与TG小鼠获得的延迟时间相比,野生型的滞后时间更大。在固定和新鲜的APP23样品之间可以看到差异。正如预期的那样,新鲜样品诱导沉积得更快。尽管如此,固定的APP23样品展示与WT的显着降低的滞后时间表明甲醛的固定不足以防止β聚集。


结论

借助Flyostar omega孔板读卡器,可以证明这一点体外测定可靠以检测脑样品中的播种活性。此外,它允许播种活动的定量比较,只能统计验证只有努力。该方法还为更大的样本队列打开,这将容易地突出体内方法的有限容量。由于数据可以更容易地获得更容易的(无动物手术和动物许可)和早期(2-3天与4-6个月)相比体内测定意味着将来取代后者的定性和定量种子测定测量。

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