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六分离株曲霉菌生成的反应性氧物质(ROS)的荧光分析

U.-c.HIPLER(1)U. Wollina(1)D. Denning(2) (1)Friedrich-Schiller大学皮肤科耶拿(2)英国曼彻斯特大学微生物学系 06/2004
  • 检测细胞内H.2O.2
  • 睡了5 nm h2O.2在200μl.
  • 每毫升> 107个细胞的LOQ

介绍

活性氧物质(ROS)是氧化代谢的必需介质。尽管如此,当过量产生时,ROS可以通过过氧化脂质并破坏结构蛋白,酶和核酸来损害细胞。在各种细胞应力期间产生过量的RO,包括缺血/再灌注,暴露于电离和紫外线和/或炎症。ROS可能有助于炎症和组织损伤。


可以使用发光分析或荧光方法监测导致ROS生成的过程。可以使用2',7'-二氯荧光吲哚(DCFH-DA)来研究细胞中的细胞内ROS,这是一种确定的化合物,用于检测和量化细胞内产生的H.2O.2


非荧光DCFH-DA转化为高荧光化合物,2',7'-二氯氟胺素(DCF),在几个步骤中发生。首先,DCFH-DA通过细胞膜传送并通过酯酶进行脱乙酰化,形成非荧光2',7'-二氯酰氟荧光素(DCFH)。该化合物被捕获在细胞内。接下来,通过通过过氧化物的作用转化为DCF的DCFH,其通过过氧化物酶存在而产生。


aspergillus.物种对几种皮肤病疾病的发病机制有兴趣。这是不确定的吗aspergillus.本身可能产生ROS,因此积极诱导组织损伤。本研究调查了吗?aspergillus.物种能够自行生产ROS,如果几种菌株之间存在差异。

材料与方法

研究了Sabouraud-glucose-琼脂(袋)的培养5周的六分离物的曲霉(AF 65,AF 71,AF 72,AF 91,AF 210,AF 294)。

在加入等渗NaCl溶液和100rpm的离心型10分钟后,通过在Casy 1(Schärfesystem)中计数可以估计囊缺血浓度。


这些细胞悬浮液浓度为105.到10.7.在与100μLDCFHDA(0.4nm)温育后,使用100μl的真菌细胞悬浮液在基德赢vwin官网客服于过滤基的BMG Labtech酶标器上测量细胞/ mL。为了消除LBS诱导的效果,将多粘菌素B(3mg / ml)加入所有实验悬浮液中。

每次测量至少16次,用于计算平均值和平均值的标准误差。


成绩与讨论

各种各样的能力曲霉物种调查生成ROS。


对于所有真菌细胞,可以根据与DCFA-DA的孵育时间观察到线性增加的荧光活性。通过使用校准曲线,将测量的荧光信号转换为H.2O.2浓度和一个例子是针对不同孵育周期的AF 71给出的(图1)。由于小尺寸的曲霉(2-3mm),仅在浓度> 10时观察到可检测的荧光5.细胞/ ml。


ROS产生表明,对细胞数的线性和直接比例依赖性,结果在3种不同的日子中再现,在37℃下的固定孵育期为2.5小时(图2)。可以以107个细胞/ ml的浓度找到最高值。

孤立的A. Fumigatus.AF 91和AF 72对伊唑康唑(抗真菌剂)和AF 65抵抗AP 65对两性霉素B(抗真菌剂)耐药。我们调查了抵抗和ROS之间是否存在连接。可以找到间度差异(图3)。

结论

真菌的形态学事件通常被认为是毒力的主要因素,与细胞内ROS形成的增加有关,其最有可能分泌。与磷脂酶一起,ROS能够破坏宿主细胞膜。该过程可能有助于A. fumigatus的侵袭性和宿主的炎症反应。


显然,致病性aspergillus.物种是以顺序和协作方式在一起以建立感染的多种参数的函数。


它已被几个作者所示,可以在线粒体电子传输过程的过程中产生水和超氧化物,过氧化氢和OH-基团。真菌还拥有正常的电子传输途径和替代途径。描述了单价氧还原与分离叶片中的节能之间的有趣联系。磷酸化点I和II处的过氧化氢形成由细胞色素C氧化过程设置。


在该研究中,利用了ROS荧光测量的方法不同的不刺激aspergillus.物种第一次。在ROS水平和胚囊孢子间浓度之间发现了线性相关性。释放的氧代谢物的病理生理学意义作为炎症反应复杂系统中的额外因子,也估计在酿酒酵母中,因此不得被排除在酿酒酵母中。

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