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6株烟曲霉产生活性氧(ROS)的荧光分析

U.-C。Hipler (1) U. Wollina (1) D. Denning (2) (1)耶拿Friedrich-Schiller大学皮肤学系(Department of Dermatology, Friedrich-Schiller University耶拿 06/2004
  • 细胞内H的检测2O2
  • LOD为5 nM H2O2200年μL
  • >的定量下限为107个细胞/ mL

表的内容

介绍

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)是氧化代谢过程中必不可少的中间体。然而,当过量产生ROS时,ROS会过氧化脂质,破坏结构蛋白、酶和核酸,从而破坏细胞。过量的ROS是在各种细胞应激过程中产生的,包括缺血/再灌注、暴露于电离和紫外线辐射以及/或炎症。ROS可能导致炎症和组织损伤。


产生活性氧的过程可以用发光分析或荧光方法进行监测。使用2’,7’-二氯荧光靛乙酸酯(DCFH-DA)可以研究细胞内ROS的产生,DCFH-DA是一种建立的化合物,可以检测和量化细胞内产生的H2O2


非荧光DCFH-DA转化为高荧光化合物2 ',7 ' -二氯荧光素(DCF)需要几个步骤。首先,DCFH- da被转运到细胞膜上,并被酯酶去乙酰化,形成非荧光的2 ',7 ' -二氯氢荧光素(DCFH)。这种化合物被困在细胞内。其次,过氧化物酶的存在使DCFH通过过氧化物的作用转化为DCF。


曲霉属真菌物种对几种皮肤病的发病机制是感兴趣的。尚不确定是否曲霉属真菌它本身可能产生ROS,从而主动诱导组织损伤。目前的研究调查是否曲霉属真菌物种能够自己产生活性氧,如果几个菌株之间存在差异。

材料与方法

6株烟曲霉(AF 65、AF 71、AF 72、AF 91、AF 210、AF 294)在sabourau - glucose - agar (BAG)培养基上培养5周。

加入等渗NaCl溶液,以100 rpm离心10 min,在casy1中计数即可估算芽孢浓度(Schärfesystem)。


这些细胞悬浮液的浓度为105到107用100 μL DCFHDA (0.4 nM)孵育后,用100 μL真菌细胞悬液在德赢vwin官网客服基于过滤器的BMG LABTECH酶标仪上检测细胞/mL。为了消除LBS的诱导效应,在所有实验悬浮液中加入多粘菌素B (3 mg/mL)。

每次测量至少重复进行16次,以计算平均值和平均值的标准误差。


结果与讨论

各种能力曲霉属真菌物种对活性氧的生成进行了研究。


所有真菌细胞的荧光活性均随DCFA-DA孵育时间呈线性增加。利用标定曲线,将测量到的荧光信号转换为H2O2以具有不同潜伏期的af71为例(图1)。由于小型烟曲霉(2-3毫米),仅在>10浓度下观察到可检测的荧光5细胞/毫升。


ROS的产生与细胞数量呈线性和正比关系,在37℃下固定孵育2.5小时,结果可在3天内重复(图2)。在107个细胞/mL的浓度下可发现最高值。

的隔离答:来自烟af91和af72对伊曲康唑(抗真菌药)耐药,af65对两性霉素B(抗真菌药)耐药。我们研究了抗性与活性氧生成之间是否存在联系。孤立间存在差异(图3)。

结论

真菌的形态事件,通常被认为是一个主要的毒力因素,与增加的细胞内ROS形成有关,这是最有可能的分泌。与磷脂酶一起,ROS能够破坏宿主细胞膜。这一过程可能与烟曲霉的侵袭和宿主的炎症反应有关。


很明显,致病性曲霉属真菌物种是一个功能的大量参数一起工作,以顺序和合作的方式建立感染。


一些作者已经证明,水以及超氧化物,过氧化氢和oh自由基可以在线粒体电子传递过程中产生。真菌还具有正常的和可选的电子传递途径。本文叙述了在分离的叶绿体中,一价氧还原与能量守恒之间的有趣联系。在磷酸化点I和II形成的过氧化氢是由细胞色素c氧化过程处理的。


本研究采用活性氧荧光测量方法对不同未受刺激的细胞进行测量曲霉属真菌第一次发现了物种ROS水平与芽孢浓度呈线性相关。在复杂的炎症反应系统中,释放出的氧代谢物作为额外的毒力因素的病理生理学意义,也在酿酒酵母中被估计,因此不排除。

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