荧光强度(包括FRET)

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什么是荧光强度?

荧光是基于光致发光,一种发光和发光的过程。这是光被物质吸收后发出的物理过程。荧光强度表示发射了多少光(光子)。这是发射的程度,它取决于激发荧光团的浓度。


荧光是由被称为荧光团的荧光分子吸收能量(光)而产生的。被吸收的能量将电子提升到一个更高的能级。由于这个激发态是不稳定的,电子回落到基态并因此发光(图1)。

吸收光子的较小部分被转化为运动和热量。因此,当电子回来时释放的能量总是小于激发电子所需的能量。由于高波辐射的精力量低于短波辐射,因此发射总是比用于激励的光更高的波长。激发和发射最大值(峰值)之间的距离称为Stokes Shift(图2)。1

激发(吸收)光于比发光光的较低波长的特性打开了使用用于分析目的的荧光强度的可能性。通过在特定波长处激发它们并在更高波长下测量它们的发光强度来检测荧光团。荧光强度与激发荧光团的浓度线性相关,并因此适合定量分析。


荧光强度广泛用于生命科学应用:在显微镜下以定位和量化生物分子,在流式细胞术中分析细胞,以及在基于微孔板的测定中,以定量分子,酶活性甚至分子之间的相互作用。该页面专注于微孔板测定中的荧光强度,就如何检测到荧光强度测量以及常用的测定。

荧光团

荧光团(也荧光染料)是荧光化合物,其可以通过光激发发光。已知成千上万的分子表现出荧光特性。2他们有所不同:

  • 分子大小

许多荧光团是小分子的化合物,可以很容易地与其他分子连接。荧光蛋白如绿色或红色荧光蛋白(GFP或RFP)体积较大,可由细胞表达。它们被用于标记蛋白的表达研究,内源性表达生物传感器或简单的作为细胞定量标记。

  • 激发和发射波长

荧光团的光激发和发射特性显示为光谱:在坐标系统中,x轴表示纳米,y轴表示强度。曲线归一化到100%,它们允许快速识别最大激发和发射波长以及斯托克斯位移。这一信息对于选择合适的荧光团进行化验是很重要的。它需要与检测系统,潜在的自发荧光和其他荧光团兼容,如果几个在实验中使用。

  • 量子产量

量子产率是衡量激发分子将吸收的光子转化为发射光的量度。结合光被吸收的程度(消光系数),量子产率给出了荧光团的亮度。

  • FRET对包括两个荧光团

FRET (Förster’s Resonance Energy Transfer)描述了从供体荧光团到受体荧光团的能量转移。当受体被来自给体的发射光激发时发生转移,并且只有当两个荧光团接近时才发生转移。FRET常用于分子结合研究生物传感器。当被分析物结合并将两个荧光团结合在一起时,后者改变它们的构象。要发生FRET,荧光团对需要在供体发射光谱和受体激发光谱之间有重叠。3.

荧光强度检测

尽管荧光团不同,但在微孔板中测量荧光强度的基础是相同的(图4):

  1. 宽带光是由光源产生的
  2. 激发波长范围从宽带光过滤
  3. 激发波长范围激发荧光团
  4. 发射光过滤了发射波长范围
  5. 探测器对过滤后的发射光进行量化

而不是吸光度在美国,荧光并不是一种绝对测量。荧光信号的强度通常与其他测量值或由仪器进行的参考测量值相关。因此,荧光板的读者用相对荧光单位(RFU)测量样品发出的光信号。

光源

  • 氙闪光灯

氙气闪光灯灯发光范围从200 nm到2500 nm。因此,它们适合于激发任何吸收紫外线范围到红外线范围的光的分子。它们具有高信号输出,寿命长。由于这些优点,在BMG LABTECH平板阅读器中采用了氙气闪光灯作为荧光激发源。德赢vwin官网客服

  • 钨卤素灯

卤素灯发出的光从大约360纳米开始,不适合测量紫外线荧光强度。与氙灯相比,钨灯在微孔板读取器荧光检测中具有较短的使用寿命、较低的输出强度和较低的灵敏度。

  • 发光二极管

发光二极管(LED)以高强度发光,但仅在特定带宽处发光。因此,不同的激发波长需要多个二极管,使得灵活地检测多种荧光团更复杂和昂贵。

波长选择

宽带励磁源可以覆盖从UV到红外光开始的宽波长范围。为了具体激发感兴趣的荧光团并避免非特异性信号,需要选择宽带激发光(过滤)仅在荧光团的激发最大值周围传输光。类似地,向荧光团的发射最大值过滤发射光。这样,只有来自感兴趣的荧光团的荧光被引导到探测器。


一些荧光强度微孔板读卡器的检测灵敏度通过使用激发和发射之间的额外选择而增强:a二向色镜子。二向色镜通常透射高于特定波长的光,而是在较低波长处阻挡光。截止在激励和发射之间位于激发光泄漏到检测器之间。

  • 过滤器

光学滤光片是具有光学涂层的薄圆形或矩形玻璃载玻片。涂层仅透射一定波长的光。具有不同激励和发射最大值的荧光团需要不同的过滤器。滤波器通常以中间传输波长命名,这通常是荧光团的激发或发射的最大值。此外,光学滤波器具有限定的带宽(或带通),这使得传输范围是多么广泛的传输范围。例如,485nm过滤器,带宽为10nm滤光器的白色光在480 490nm之间的范围内。

  • 单色仪

与光学过滤器相反,单色器能够根据要求选择不同波长的光。两种类型的单色器用于微孔板读者:常规的基于光栅的单色器或线性可变滤光器单色器。在基于光栅的单色器中,通过白光衍射到其颜色中选择波长。然后通过狭缝选择波长,该狭缝物理地阻挡不需要的光并仅发送所需的光。光栅方法的缺点是低光传输和杂散光的发生,这可能达到检测器并降低整体荧光敏感性。


线性可变滤波器(LVF)单色仪克服了斯特莱拉明问题,因为它不会分解光线,但字面上过滤它。LVF单色仪使用具有梯度涂层的两个载玻片。可以通过将两个线性滤波器彼此滑动来选择任何带宽的波长。LVF单色仪具有滤光片状透射,消除晶体闪光灯,因此具有比衍射单色器更好的性能(图6)。Microplate Reader中的线性可变滤波器通过BMG Labtech是一种专利技术。德赢vwin官网客服

探测器

用光电子管(PMTS)检测微孔板读取器中的荧光强度。它们将信号乘以使用光电效应并将光转换为电信号。对于微孔板读取器中的荧光强度测量,使用两个不同的PMT,其在其敏感波长范围内不同。低噪音蓝/绿色PMT在高达740nm的范围内敏感,并且通常也用于发光测量。红移PMT敏感地测量荧光高达900nm,因此还覆盖了红色和红外染料。这些通常用于基于细胞的测量,因为在该波长范围内降低了自发荧光。


如何在平板阅读器上设置荧光测量

微型板块

荧光强度量化需要一个黑色板,因为它减少了背景和激发光的反射。关于车牌选择的更多细节见我们的博客文章"哪一种酶标板最适合我的实验?“。

过滤器和单色器设置

选择合适的滤光片对于精确地测定荧光强度至关重要。如前所述,平均波长应达到或接近激发和发射的最大值。然而,有几件事要记住:

  • 过滤器之间的距离

如果激励和发射过滤器的边缘彼此太靠近,则激发光可能泄漏并到达检测器。然后荧光团的信号在激发光中消失,不再可测量。过滤器可以是多么接近,取决于过滤器的质量和二向色镜的使用。通常,最高透射的激励和最低透射发射波长应分开30nm(图7)。

  • 带宽

滤波器的带通量从几纳米的几何方式变化,高达100nm。带通会影响可以通过过滤器的光量。对于明亮的荧光团或具有高自发荧光的复杂样品,建议低带宽过滤器(〜10nm)。典型的例子是绿色荧光团,例如综合环境中的alexafluor488,fitc或gfp。


如果它们在自发荧光低(发射<600nm)或缓冲液不含其他荧光化合物的范围内,则建议更广泛的带宽过滤器。德赢vwin官网客服BMG LabTech根据荧光团激励和发射光谱选择过滤器。此外,滤波器对彼此测量并匹配,以确保您正在收到最佳的过滤器。常用荧光团的默认设置也已存储单色器,以便将此选择工作留给研究人员。

  • FRET测量需要两个发射通道

上述考虑也适用于FRET测量。但是,必须注意,必须单独记录两个排放。如果没有接地,则激发的供体荧光团在特定波长处发光。如果受体荧光团接近,则供体将能量转移到受体,然后将光发射在更高波长处。这意味着需要两个发射滤波器,其中一个只允许捐赠者发射,另一个发射滤波器和另一个发射滤波器才能传播。

获得

增益是一个放大因子,或者更准确地说,是入射光信号被放大的检测器的电压。改变增益会使检测的动态范围沿着分析物/测定物的浓度曲线移动。然而,动态范围的宽度是固定的,不会改变。


弱信号需要大放大(高增益),亮信号需要较少放大(小增益)。选择错误的增益可以使测量数据无法使用,因为它要么超过测量范围,也不再解决差异。通常将增益设置为在样品上具有最大测量输出,具有预期的最高强度。这是为了使最大和最低测量值之间具有最大可能的动态窗口(图8)。


所有BM德赢vwin官网客服G Labtech微孔板读卡器自动确定增益,提供了特定良好的特定信号强度。但是,在www.v66088.com 不需要调整增益。该增强动态范围(EDR)技术专门设计用于提供最大的动态范围 - 8个集中数十年。这为微孔板测量提供了前所未有的便利性,因为可以在没有手动干预的大型动态范围内测量高度可靠的结果。

焦点

检测到信号的高度对测量的灵敏度具有显着影响。在不最佳的焦平高度下测量可以将信号降低至90%。例如,粘附的荧光细胞需要靠近板底测量,而均匀的荧光溶液在液体表面下方提供最高信号并且取决于井的填充量。一些板读者确定所选井中的最佳焦平高度。Clariostar.®Plus则更进一步,在读取底片时自动确定焦距。

荧光测定 - 用于荧光强度的用量是什么?

荧光测定的数量与他们可以回答的生物学和化学质检的数量一样大。因此,基于荧光强度的最常见应用概述如下。


细胞活力和细胞毒性测定

细胞是否被化合物伤害或癌细胞在治疗后死亡是常见的问题,可以通过荧光活性、细胞毒性试验和酶标仪来回答。在alamarBlue™试验中,reazurin被代谢活跃的细胞降低为荧光团,并报告细胞活力。另一种评估细胞活力的方法是将荧光标记的核苷掺入DNA中。它们结合在一起,因此只有在DNA复制发生时才发出荧光,这是生存能力的标志。


一种通过荧光强度检测细胞死亡的方法是基于荧光DNA染料,如SYBR®绿色或Celltox™绿色。染料是不透细胞的,但如果在细胞死亡期间细胞膜被破坏,染料暴露在溶液中的DNA中,然后开始荧光(图9)。这些分析与实时测量兼容,可以监测细胞健康随着时间的推移。由于这些测量是在几天内完成的,微孔板室需要在37°C和5% CO孵育2让细胞快乐。Clariostar Plus与大气控制单元为长期的细胞实验提供了理想的环境。更多的细胞健康测试在我们的博客文章中有描述细胞活力测定 - 测量您的细胞所在的快乐“。

酶活性测定

随着酶参与多种生物学过程,研究抑制剂或启动子如何影响酶活性非常重要。酶测定原理是可比性的:它们采用预荧光基底,其在酶加工后释放荧光团。常见的荧光团基于香豆素衍生物,例如在表观遗传酶组蛋白去乙酰化酶1 (HDAC1)的荧光检测


酶测定中使用的第二个荧光团是4-甲基伞形睾酮。有关的例子载于申请须知"Clariostar在基于FOorescent的测定中确定苔藓产生的人酸α-葡糖苷酶(GaA)的活性“。Clariostar.微孔板读卡器使荧光酶活性分析容易。增强的动态范围技术允许读取8数十年的动态范围。这样,容易记录酶活性测定中的增加信号而不会选择错误增益或耗时仪器优化的风险。该仪器配备了一家免费分析软件,具有含有Michaelis-Menten和Lineweaver-Burk造型的综合酶动力学分析(酶动力学测量在BMG LABTECH酶标仪上进行德赢vwin官网客服)。


蛋白质聚合化验

如果蛋白质错误折叠,它们就会聚集,而聚集与阿尔茨海默病、帕金森病和朊病毒病等疾病相关。对分子聚集物形成的分析有助于诊断和了解这些疾病,以及测试潜在的药物。两种荧光基团双硫脲和硫黄素T (ThT)在与蛋白质聚集物相互作用时荧光强度增加。Bis-ANS最好能与应用笔记中描述的非晶聚集物相互作用"使用BMG LAB德赢vwin官网客服TECH微孔板阅读器监测淀粉样蛋白的形成“。


与原纤维结合,主要用于动力学测定。如果样品含有聚集诱导分子,则重组蛋白质聚集体和荧光增加(图10)。

应用笔记“朊病毒播种的实时震动诱导转化试验解释了如何用这种方法检测朊病毒疾病在仓鼠大脑匀浆中的痒病。由于这些聚合分析需要长期的振动,BMG LABTECH的微孔板阅读器可以配备非常坚固耐用的传输系统。德赢vwin官网客服

活性氧测定

活性氧物质(ROS)在免疫应答期间内源性释放。由于其DNA损伤性质,外源生成的ROS参与疾病。在氧化时变荧光的非荧光分子通常用作ROS测定的染料。在博客柱中概述了用于活性氧物质检测的机制,衍生物和进一步的荧光方法“活性氧检测“。

DNA和RNA定量

量化核酸的基于荧光强度的测定对于测序应用非常流行。这些需要具有高特异性的精确样本量化,如我们博客所述下一代测序(NGS),为什么量化确切的DNA / RNA很重要


许多生命科学化学供应商提供不同浓度范围的DNA和RNA定量分析,具有不同的特异性,不同的荧光特性。不同套件的比较以及它们在BMG LABTECH阅读器上的表现可以在应用笔记中找到。”德赢vwin官网客服采用吸光度法和荧光法进行DNA定量。“

钙测定

钙离子表明膜受体的活化,调节肌肉收缩和血液凝固。基于荧光强度的测定用于研究任何这些中的任何一个如我们博客文章所述钙测定:在生物学中心“。细胞内钙变化的分析需要荧光微孔板读卡器,如ClarioStar Plus,具有高时间分辨率,如应用笔记所示“iPSC中的实时钙通量测量可获得3D心脏组织“以及可能在37°C和5%CO中保持细胞的可能性2

参考文献

1. Lakowicz JR,荧光光谱原理,第三版,2010
Juan Carlos Stockert,AlfonsoBlázquez-Castro(2017年)。“第3章染料和氟氯化物”。生命科学中的荧光显微镜。Bentham Science出版商。第61-95页。ISBN 978-1-68108-519-7。
3.降低BT、王,张年代,林MZ,楚j .指南荧光蛋白烦恼对。传感器(巴塞尔)。2016; 16(9): 1488。2016年9月14日出版doi: 10.3390 / s16091488

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