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基于荧光偏振的快速、精确、高通量测量IgG和Fc的衍生物

Carolanne Doherty博士 Valitacell,Nibrt,FoSters Avenue,Blackrock,Dublin,爱尔兰 11/2017
  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板阅读器使新型IgG定量方法的测量成为可能
  • Valita™滴度法使用荧光偏振直接测定细胞培养上清中的IgG
  • 预配置的测量协议和分析促进和加速定量

表的内容

总结

准确、快速和高通量的IgG测量在大多数治疗性抗体的开发和制造中是必不可少的。单克隆抗体在生物制药中越来越占主导地位,在开发每一种潜在的治疗方法时必须筛选大量样本。


在此,我们报告了一种新颖、快速、简单的方法荧光偏振基于高通量测定IgG和fc衍生物效价的方法。它使用荧光标记的结合IgG的蛋白G。绑定后,发射光的去极化减弱,这可以检测到IgG的存在。的www.v66088.com ,PHERAstar®北极星®当与validatiter检测一起使用时,表现出优秀的检测质量,这使一种高通量,简单,精确的方法可以定量IgG。此外,可以使用样品直接细胞培养上清进行检测,这意味着不需要复杂的样品制备步骤。

介绍

准确、快速和高通量的IgG测量在大多数治疗性抗体的开发和制造中是必不可少的。单克隆抗体在生物制药中越来越占主导地位,在开发每一种潜在的治疗方法时必须筛选大量样本。在这里,我们提出了Valita™滴度测定,一种新的定量IgG细胞培养上清。


目前的工作流程,包括HPLC protein A, ELISA, protein A表面干涉法,和HTRF(均质时间分辨荧光)有主要的缺点,包括昂贵的,劳动密集型的方法和长时间的分析时间。


的ValitaTM滴度测定法提供了一个非常准确和经济有效的解决方案,测量范围从2.5-80mg/L IgG。的ValitaTM效价测定依赖于通过荧光偏振测量检测IgG Fc与蛋白G的相互作用(图1)。该测定采用96孔格式,简单,高通量,快速,完全自动化。分析可在低样本量的细胞培养基中进行,无需复杂的制备步骤。


在本应用笔记中,我们展示了使用Valita进行IgG定量的最佳方案TM滴度测定试剂盒由PHERAstar获得®, POLARstar®omega和clariostar®板的读者。

FP有效地分析了分子大小的变化。通过偏振光激发的“固定”FLOOROCHORE优先发光在相同的极化平面中。然而,光子吸收和发射之间的分子的旋转具有“扭曲”光的偏振的效果。小分子在溶液中比较大分子更快地翻滚。因此,可以使用光去极化程度来测量与相关的流动团的分子尺寸的变化。因此,当流体标记的蛋白质g是未结合的时,它迅速翻转并使光倍增,而不是当它与IgG结合时(即较大的5倍)(图2)。这种极化的变化用于测量溶液中IgG的量。通过用平面偏振光激发溶液并测量平行于激发光(偏振比例)和垂直于激发光(去极化部分)的平面发射的光强度来测量FP。FP表示为这两个强度的归一化差异,其通常为千兆化单元(MP)。


材料与方法

  • Valita™效价测定装备
  • Valita™应用软件(提供)
  • IgG标准(人血清IgG)
  • Pherastar,Polartar Omega和Clariostar(BMG Labt德赢vwin官网客服ech)

实验程序
样品根据各自的产品使用说明准备。按照IFU标准用IgG标准品制备标准曲线。取60 μl ValitaMab重组缓冲液,移液至各孔TM滴度板,配以60 μl的标准品和样品。将内容混合并在黑暗中培养30分钟,然后使用BMG LABTECH软件中预先配置的协议在北极星、pherstar和CLARIOstar平板阅读器上阅读(详细设置如下)。德赢vwin官网客服然后使用ValitaAPP软件,从原始数据中导出csv文件,分析数据。

仪器设置

PHERAstar Clariostar. Polartar omega.
光学设置 荧光偏振、端点
过滤器
光模块FP 485 520 520 例:482 - 16
二向色性:LP504
新兴市场:530 - 40
例:485
新兴市场:520
在测量之前对焦和增益调整(样品:0 mg / ml)
70 mP目标mP
一般设置 每井200闪烁
0.5 s稳定时间

结果与讨论

标准曲线(2.5 ~ 80 mg/l)用Valita定量TM滴度分析三FP能力多模式阅读器由BMG LABTECH(北极星Omega, CLARIOstar和PHERA德赢vwin官网客服star)。所有读取器显示重复测量的低变化(图3)。

最后,瓦里塔TM效价IgG定量测定法与传统的IgG定量法进行了比较,采用了一系列不同条件的细胞培养液样本。图4显示了两种方法的相关性,并显示了Valita的两种定量分析的相似精度TM由于其均质形式而无需复杂样品制备,滴度更快。

结论

在这些生物制药的开发和生产过程中,从混合样品中快速测定IgG浓度的能力特别重要和有价值。在这里,我们报道了一种新的,快速,简单的基于荧光偏振的测定方法,用于高通量测定IgG和fc衍生物的滴度。Valita™滴度分析允许直接定量的IgG从过程样品,没有样品制备或纯化步骤。在使用Valita™滴度测定时,CLARIOstar, pherstar和北极星表现出优秀的检测质量。与其他方法相比,Valita滴度是一种高通量、简单、精确的IgG定量方法。


参考文献

1.Thompson, B. et al.(2017)利用荧光偏振光谱对细胞培养上清中含fc的重组蛋白进行高通量定量,分析生物化学534:49-55。

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