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基于荧光偏振的快速,精确,高通量测定IgG和Fc含衍生物

Carolanne Doherty博士 Valitacell,Nibrt,FoSters Avenue,Blackrock,Dublin,爱尔兰 11/2017
  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH酶标仪使新型IgG定量方法的检测成为可能
  • valita™滴度测定使用FOORESCEACE偏振,直接测定IgG在细胞培养上清液中
  • 预先配置的测量协议和分析便于和加速定量

表的内容

总结

IgG的准确、快速和高通量检测是大多数治疗性抗体的开发和制造中必不可少的。单克隆抗体在生物制药领域越来越占主导地位,为了开发每种潜在的治疗方法,必须筛选大量的样本。


在这里我们报道一种新颖、快速和简单的发展荧光偏振用于高通量测定IgG和含fc衍生物的效价。它使用荧光标记的蛋白G与IgG结合。结合后,发出的光的退偏振减小,这可以检测到IgG的存在。的www.v66088.com PHERAstar®北极星®当与ValitaTITER分析一起使用时,显示出优秀的分析质量,这使得一种高通量,简单,精确的方法用于IgG的定量。此外,本试验可采用样品细胞培养上清进行,无需复杂的样品制备步骤。

介绍

IgG的准确、快速和高通量检测是大多数治疗性抗体的开发和制造中必不可少的。单克隆抗体在生物制药领域越来越占主导地位,为了开发每种潜在的治疗方法,必须筛选大量的样本。在这里,我们提出了Valita™滴度测定法,一种用于细胞培养上清中IgG定量的新方法。


目前的工作流程包括高效液相色谱蛋白A、ELISA、蛋白A表面干涉法和HTRF(均质时间分辨荧光法)等,但存在成本高、劳动强度大、分析时间长等缺点。


百塔TM滴度法提供了一个非常准确和经济的解决方案,以测量IgG在2.5-80mg/L范围。百塔TM滴度测定依赖于通过荧光偏振测量检测IgG Fc与蛋白G的相互作用(图1)。该测定方法具有96孔格式,简单、高通量、快速和全自动。分析可以在细胞培养液中进行,样品量低,无需复杂的制备步骤。


在此应用笔记中,我们显示使用valita执行IgG量子的最佳协议TM由pherastar获得的滴定法试剂盒®, POLARstar®omega和clariostar®板的读者。

FP有效地分析了分子大小的变化。通过偏振光激发的“固定”FLOOROCHORE优先发光在相同的极化平面中。然而,光子吸收和发射之间的分子的旋转具有“扭曲”光的偏振的效果。小分子在溶液中比较大分子更快地翻滚。因此,可以使用光去极化程度来测量与相关的流动团的分子尺寸的变化。因此,当流体标记的蛋白质g是未结合的时,它迅速翻转并使光倍增,而不是当它与IgG结合时(即较大的5倍)(图2)。这种极化的变化用于测量溶液中IgG的量。通过用平面偏振光激发溶液并测量平行于激发光(偏振比例)和垂直于激发光(去极化部分)的平面发射的光强度来测量FP。FP表示为这两个强度的归一化差异,其通常为千兆化单元(MP)。


材料与方法

  • Valita™效价测定装备
  • Valita™应用软件(提供)
  • IgG标准(来自人血清的IgG)
  • Pherastar,Polartar Omega和Clariostar(BMG Labt德赢vwin官网客服ech)

实验程序
样品是根据各自的产品说明书准备使用。以IFU为标准品制备IgG标准曲线。每孔吸入60 μl ValitaMab重组缓冲液TM滴定板,装有60 μl制备的标准品和样品。将内容物混合并在黑暗中孵育30分钟,然后使用BMG LABTECH软件中预先配置的协议,用北极星、PHERAstar和CLARIOstar平板阅读器读取内容物(详细设置如下)。德赢vwin官网客服然后使用ValitaAPP软件从原始数据导出.csv文件,对数据进行分析。

仪器设置

PHERAstar Clariostar. Polartar omega.
光学设置 荧光极化,终点
过滤器
光模块FP 485 520 520 例:482 - 16
二向色性:LP504
嗯:530-40
例:485
新兴市场:520
在测量之前对焦和增益调整(样品:0 mg / ml)
70mp目标mP
一般设置 每井200闪烁
0.5 s沉降时间

结果与讨论

标准曲线(2.5- 80mg /l)用Valita定量TM采用BMG LABTECH (POLARstar Omega, CLARIOstar和PHERAstar)对德赢vwin官网客服3种FP能力的多模式解读器进行滴度测定。所有读取器的重复测量值变化很小(图3)。

最后,瓦里塔TM将滴度IgG量化法测定与HPLC的常规IgG定量进行比较,并使用一系列差分调节细胞培养介质样品。图4显示了两种方法的相关性,并显示了与valita的量化测定的类似精度TM由于其均质形式而无需复杂样品制备,滴度更快。

结论

在这些生物制药的开发和制造过程中,快速确定来自​​混合样品的IgG浓度的能力是特别重要的。在这里,我们报告了基于IgG和含Fc的衍生物的高通量滴度测量的基于新的,快速和简单的流动偏振。valita™滴度测定允许从工艺样品中直接量化IgG而无需样品制备或纯化步骤。当与Valita™滴度测定一起使用时,Clariostar,Pherastar和Polarstar表现出优异的测定质量。通过与替代方案进行比较,valita™滴度是IgG的量化的高通量,简单,精确的方法。


参考文献

1.Thompson, B.等(2017)利用荧光偏振光谱法高通量定量细胞培养上清液中含fc的重组蛋白,Analytical Biochemistry 534: 49-55。

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