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荧光偏振法适用于h -前列腺素D合成酶抑制剂的筛选

卡尔•彼得斯 德赢vwin官网客服 07/2015
  • 前列腺素D合酶(造血型)基于FP的抑制剂筛选试剂盒提供了一种坚固且易于使用的测定
  • 无论是CLARIOstar®和PHERAstar®FS.擅长于基于荧光偏振的检测

表的内容

介绍

前列腺素是一组脂质化合物,这些化合物涉及动物生理学中的不同作用。Prosta-Grandin D2(PGD2)的特征在于其在哮喘中的作用,其浓度在暴露于过敏原后导致支气管呼吸道造成的哮喘患者的浓度较高。出于这种情况和其他原因,抑制剂旨在催化催化前列腺素D合酶(H-PGDS),其催化催化FINAL PGD2生物合成步骤。


在这里,我们展示了Cayman Chemicals Green FP基抑制剂测定筛选试剂盒的性能。用Clariostar和Pherastar测试套件FS.。还测试了更适合高通量筛选(HTS)的设置。


测定原理

以前列腺素D合成酶为基础的抑制剂筛选方法提供了一种简便的一步法。将H-PGDS抑制剂偶联到荧光素上,发现了其他抑制剂,它们可以取代探针与H-PGDS的结合(图1)。

当FL Uoutcein共轭探针与H-PGDS相互作用时,检测高FP信号。抑制剂破坏探针的结合,并且自由探针表现出低FP信号。


在没有有效抑制剂的情况下,探针将保持与H-PGDS的结合,从而降低探针的旋转自由度,导致高FP信号。增加有效抑制剂的浓度将导致增加量的位移探针。移位探针具有增加的旋转自由度,因此具有更低的FP信号。


这种检测方法避免了传统的多步检测方法的需要,即使用高度不稳定的pgd2前体PGH2。

材料与方法

  • 前列腺素D合成酶(造血型)基于FP的抑制剂筛查分析套件 - 绿色(Cayman Chemicals#600007)
  • PHERAstarFS.和CLARIOstar microplate阅读器(BMG LABTE德赢vwin官网客服CH)
  • 抑制剂和其他试剂是从商业来源购买的

为了测试试剂盒功能,制备2个已知的H-PGDS抑制剂的点滴定曲线;HQL-79(在试剂盒中提供)和TFC 007.另外,制备了类似的滴定曲线,用于56型脂质素蛋白型PGDS(L-PGDS)抑制剂。对于所有2倍的串联稀释液是在DMSO中进行的。


根据试剂盒说明制备试剂试剂,以创造测定鸡尾酒。将47.5μL这种鸡尾酒移液到384孔板的孔中。接下来是2.5μL适当的抑制剂浓度或DMSO作为阴性抑制控制。对于TFC 007,滴定曲线中的第1点的第1点的第一点的浓度为2.5mm,250μm。在室温下孵育90分钟后,使用以下设置读取板:

Clariostar设置

测量方法: 荧光极化,终点
过滤器设置: 482-16 / LP 504 / 530-40
解决时间: 0.1秒
闪光的数量: 200.
焦点和收益: 测量前调整
目标像素: 200 MP在DMSO控件上设置


PHERAstarFS.设置

测量方法: 荧光极化,终点
光学模块: FP 485 520 520
解决时间: 0.3或0.1秒
闪光的数量: 200年或10
焦点和收益: 测量前调整
目标像素: 200 MP在DMSO控件上设置

结果与讨论

首先,我们想通过对H-PGDS FP荧光探针-绿色进行光谱扫描来确认选择了合适的滤光片(图2)。荧光素共轭探针的表现与预期一致,确认了CLARIOstar滤光片和PHERAstar滤光片的选择FS.光学模块。

图3中示出了对用克拉克罗斯塔检测的抑制剂处理的响应。该测定基于计算的Z'值为0.84,测定表现出高质量。

由4个参数的拟合曲线可以确定集成电路50抑制H-PGDS。TFC 007展示集成电路5045 nM,与报道的83 nM值相当。HQL-79报告有IC50在6μm2并且在该实验中表现出IC5013μm。在56处是一种L-PDGS选择性抑制剂,并据报道,在高达100μM3的浓度下对H-PGDS没有影响。这里显示的结果预测了IC501.9 mm,但需要进一步分析较高的浓度。

的PHERAstarFS.提供类似的鲁棒检测(表1)。因此,我们测试了是否可以采用更有利于高温超导的设置。图4显示了使用10个闪光显示pherstar的结果FS.保持性能预测类似IC50用Clariostar看到的价值观。

表1显示PHERAstar保持了出色的化验质量FS.即使使用HTS设置。

闪光/稳定时间 Z” 384井读取时间
200 / 0.3 0.82 7分钟
10 / 0.1 0.74 1分33秒

结论

Clariostar和PherastarFS.当用于阅读Cayman前列腺素D合酶FP抑制剂筛选测定时,表现出优异的测定质量。此外Pherastar.FS.即使使用更适合高通量的设置,也能保持检测质量。


参考文献

1.Nabe T.等(2011)前列腺素其他脂质介质95(1-4)27-34
2.Artiake K. et al. (2006) J. Biol。281化学(22)15277 - 15286。
3.Irikura, D.等(2009)J. Biol。化学,284(12)7623 - 7630。

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