326

基于荧光偏振的RNA合成分析

斯蒂芬·赖希,斯蒂芬·库萨克 欧洲分子生物学实验室 10/2018
  • hts -兼容检测方法鉴别流感病毒聚合酶(FluPol)化合物
  • 适合FluPol的酶特性和作用机制研究
  • CLARIOstar的FP检测系统提供了可靠的检测

表的内容

介绍

流感病毒是全球公共卫生的主要威胁。病毒传播的关键是病毒RNA依赖的RNA聚合酶(FluPol),它扩增病毒基因组并转录编码病毒蛋白的mrna。FluPol, ~ 260 kDa多功能heterotrimeric复杂,是一个有吸引力的目标,抗流感药物发现(1)。在这里,我们提出一种新颖的荧光偏振分析直接读取由FluPol RNA合成(2)。此外,分析适用于测量一般RNA合成和兼容大规模筛选。


测定原理

荧光标记核酸的荧光偏振(FP)对荧光团环境的构象是敏感的。具体来说,fam标记的单链RNA的FP在变成双链时增加(图1)。使用18个核苷酸的5’端fam标记的单链“模板”RNA,信号幅度最高(∆FP奥林匹克广播服务公司),当加入18 nt互补RNA(黑色)时,可以观察到,结果是一个完美的18 bp dsRNA。通过将互补RNA分别缩短到16 nt(黄色)或14 nt(紫色),增加荧光团的单链环境,降低了∆FP奥林匹克广播服务公司max。

18 nt(黑色)和16 nt(黄色)完全互补的RNA的活性位点滴定观察,而非完全互补的14 nt RNA(紫色)的相互作用对应于KD~ 0.5μM。请注意,改变RNA序列或杂交强度可能会影响∆FP奥林匹克广播服务公司在fp信号与产物RNA量成正比的地方,取最大值并移动检测限。5 '端FAM-labelled 18元“模板”实际上RNA这里使用对应于流感病毒启动子3 ' RNA这作为模板FluPol RNA合成的生化检测体外(2),这将产生一个互补的18元产品RNA以一定的速度,如果它与FAM-labelled FP-signal模板将产生变化。之前记录的FP-signal酶催化RNA合成,反应需要淬火(如高盐)分离FluPol和RNA,同时允许RNA-RNA-interactions(图2)。有了这个“诡计”,观察到的贡献FP-signal FluPol和FAM-labelled模板RNA相互作用去除,发现FP-signal成正比的比例产品RNA模板RNA(图1)。

材料与方法

  • 寡核苷酸(IBA Lifesciences)
  • 引物(5’-(N7MeGppp)AAUCUAUAAUAG-3’),2’f -2’dntps (Trilink Biotechnologies)
  • 国家结核控制规划(σ)
  • 流感病毒B聚合酶;赖希等,2014)
  • 384孔板(Greiner, #781076)
  • CLARIOstar®(德赢vwin官网客服BMG LABTECH)

RNA合成按所述进行。简单地说,RNA合成是通过补充0.25 μM FluPol(流感B聚合酶;与v5 ' RNA nts 1-14结合),0.15 μM fam标记的模板RNA (5 ' -(FAM-Ex-5) UAUACCUCUGCUUCUGCU-3 '), 0.5 μM引物和25 μM NTPs(每个)在检测缓冲液(50 mM HEPES/NaOH, 150 mM NaCl, 10% (v/v)甘油,5 mM MgCl2, 2 mM TCEP, 1% (v/v) DMSO, pH = 7.4)。在聚丙烯反应管中进行RNA合成,在规定的时间内将10 μl的等量转移到80 μl的淬灭溶液(4.5 M NaCl)中,然后使用CLARIOstar在384个微孔板中记录fp信号®(德赢vwin官网客服BMG LABTECH)。J. Timmins博士(IBS格勒诺布尔)是公认的访问微孔板阅读器。


仪器的设置

光学设置 荧光偏振、端点
过滤器 例:482 - 16
二向色性:LP504
新兴市场:530 - 40
专注和获得 调整前测量
目标像素 35
闪光 每口井的50
一般设置 建立时间 0.1秒

结果与讨论

利用所述RNA合成方法,可以对流感病毒聚合酶进行酶学表征在体外,如启动子RNA需求、引物效率、K(ntp),更替数,起始策略或抑制(2)。RNA合成动力学是最有信息的,它报告了产物的数量和产生速率。图3显示了在25 μM ntp(黑色)条件下,FluPol(带帽RNA引物)催化RNA合成的完整动力学以及增加抑制剂2'F-2'dCTP (X;紫色(8 μM)至深红色(8.3 mM)。进度曲线根据伪一级速率定律(实线)进行双指数拟合,从而得到RNA合成速率常数k (min-1)。

图4显示了显著的、快速的RNA合成阶段对应的速率常数,打开黑色圆圈,得到一个IC50(2'F-2'dCTP) 0.2 mM。当在规定的反应时间内(线性范围内)猝灭合成反应时,该方法与高通量筛选活动兼容。图4显示了在图3所示条件下ntp类似物的剂量-响应曲线,但只允许RNA合成5分钟,并产生如IC50(2’f -2’dctp) = 0.2 mM(图4,黑色方块),与IC一致50- 从完整动力学中确定的值(图4,黑色开放圈)。

结论

我们开发了一个简单的在体外RNA合成测定法利用与氟酚催化产品RNA形成相关的FAM标记的模型RNA的FORESPEAT偏振变化。测定是高通量兼容,可以在384个孔微孔板中轻松进行。它可靠地报告抑制RNA合成的化合物,容易地将小型化至重组(活性)氟酚的0.2 pmole /反应,并且可以为药物发现活动提供有吸引力的选择。


参考资料

1.Pflug等,病毒研究,2017年4月15日;234:103-117。doi: 10.1016 / j.virusres.2017.01.013
2.赖希等,核酸研究2017年4月7日;45(6): 3353 - 3368。doi: 10.1093 / nar / gkx043

去前