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荧光偏振可分解绿色荧光蛋白干扰自发荧光

安德鲁W.骑士 Gentronix Ltd. 06/2007
  • 荧光偏振(FP)光学的新用途
  • 荧光偏振技术在酵母基因毒性测定中的应用
  • 尽管掩盖自发荧光,通过GFP表达鉴定的基因毒性物种

表的内容

介绍

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)是一种广泛应用于基因表达报告的标记物。然而,GFP的荧光测量(除非它非常高表达)总是受到细胞或培养基的内源性自身荧光的污染。本文描述了一种新的荧光偏振(FP)光学的使用,可在BMG LABTECH的微孔板阅读器上,它可以显著提高GFP荧光的分辨率,在不需要的自发荧光存在。德赢vwin官网客服在一项基因毒性试验中,reader已被用于区分GFP在酵母细胞中的表达,其中测试化合物本身具有高度的自身荧光,通常会掩盖GFP,使毒性评估不可能。


理论

当用平面偏振光照射GFP时,由于其相对大的尺寸和慢速旋转,高比例的发射荧光相对于激发源保持偏振。对GFP的偏振度(P)为约0.40(400mP)。荧光素,显示出低荧光各向异性,由于其小尺寸和快速旋转。因此通过取得两个偏振荧光测量值(ipar- 一世),获得的信号对绿色荧光蛋白来说很大,但对自然产生的自发荧光物种来说很小。

实验

酵母细胞与连续稀释的化合物在微孔板中进行试验。当细胞的DNA修复机制被激活时,当暴露于一种基因毒性化合物时,这种酵母菌(酿酒酵母)已经被转基因,可以表达绿色荧光蛋白。


通过测量细胞增殖程度同时进行一般细胞毒性(细胞毒性)的评估。第二酵母菌株不表达GFP用作对照。


使用BM德赢vwin官网客服G Labtech微孔板读卡器从板的顶部进行荧光测量(激发过滤器= 485-12,发射过滤器= 520-30),以及细胞密度评估的吸光度(过滤= 620nm)。使用的微孔板是矩阵技术,96孔,黑色,透明底板。将75μL连续稀释的试验化合物与75μl酵母细胞试剂合并。该板还包含各种标准化合物和坯料。微孔板并在25℃下孵育过夜。由于测试化合物的毒性影响所达到的最终细胞密度,因此荧光读数被归一化为存在于形成“亮度读数”的细胞数量。从而:

成绩与讨论

试验采用10种连续稀释(32.5 μg/mL)的甲基磺酸甲酯(MMS),一种已知的基因毒性烷基化剂,同时对试验菌株和对照菌株进行检测。样品中加入了185 ng/mL荧光素,一种强荧光光谱模仿GFP的物质,以及本研究中的模型自荧光化合物。GFP在517 nm处荧光,荧光素在512 nm处荧光。

采用常规荧光法(图1),供试菌株和对照菌株的荧光均随着化合物浓度的增加而增加;这意味着在试验菌株中GFP的诱导被有效地掩盖了,使遗传毒性评估成为不可能。


图2显示施加荧光偏振方法,来自试验和控制菌株的荧光信号现在分离,因为从添加的荧光素中除去荧光。随着MMS浓度的增加,试验菌株的GFP诱导的剂量依赖性增加现在是显而易见的。

该方法被用于分析两种化合物,这两种化合物在GFP波长处具有高荧光性。它们分别是原黄素(513.5 nm)和甲基吡啶(515.0 nm)。使用常规荧光法,这两种化合物(图3和图4)都不能可靠地归类为基因毒素。

荧光偏振鉴别法(图5和图6)清楚地显示了与未表达对照菌株相比,试验酵母菌株诱导了GFP;从而证实这两种化合物在本试验中具有遗传毒性。

结论

利用GFP的固有荧光各向异性,实现了一种用于区分GFP干扰自发荧光物种的新方法。使用BMG Labtech微孔板读卡器上可用的偏振光器进行测定。德赢vwin官网客服


该方法允许培养型和甲基甲基甲基甲基脲鉴定​​为遗传毒性物质,其使用常规测量是不可能的。

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