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使用Biotium的AccuBlue NextGen荧光定量低量dsDNA

Alexis Madrid(1)Carl Peters(2) (1)Biotium Inc.,Fremont,CA(2)BMG L德赢vwin官网客服abtech Inc.,NC,USA 05/2017
  • Clariostar.®能够在96孔板中对位于1至3000pg的DSDNA进行敏感检测
  • 384孔板的检测提供了保存珍贵样品的可能性,具有卓越的检测灵敏度

概要

敏感DNA的定量在样本中对诸如法医DNA分析的应用至关重要,其中可能存在低量的DNA。同样,准确DNA量化对于下一代测序(NGS)来说是至关重要的,因为需要精确数量的DNA,才能使这一强大的工具用于研究导致癌症或疾病的突变所涉及的遗传现象。荧光定量方法已经证明了其准确性和优良的灵敏度。

在这里,我们展示了使用AccuBlue™NextGen试剂检测DNA的性能www.v66088.com 微孔板读者。它具有能够实现Accubly NextGen DSDNA定量套件的最佳性能的灵敏度。我们在所有DNA浓度上获得了优异的线性度,并观察到96和384孔板中的LOD值比以前报道的更好。因此,这种组合在DNA定量方面提供了优异的敏感性,并且在需要时能够保护样品。

介绍

样品中DNA的敏感量阳离子对诸如法医DNA分析的应用至关重要,其中可以存在低量的DNA。类似地,精确的DNA量化为下一代测序(NGS)至关重要,其中需要精确的DNA,以使这种有力的工具能够在导致癌症或疾病的突变中涉及的遗传现象进行调查。荧光量化方法已经证明了准确性和优异的敏感性。分析染色染料表明归因感TM值Biotium的NextGen表现出最佳敏感性1


在这里,我们展示了DNA量子使用ACCUBLE的性能TM值NextGen试剂具有ClarioStar微孔板读卡器的检测。结果表明,读者和试剂的这种组合提供了优异的敏感性,延伸到384孔板中的检测。

测定原则

通过Accublue来实现低浓度DNA的检测TM值NextGen通过在没有核酸的情况下使用具有低内在杂志的染料,但在DNA存在下大的流动性增强。此外,使用专利的增强剂技术进一步抑制背景流荧光导致均匀的检测限(图1)。

材料与方法

  • 归咎于TM值NextGen DSDNA量化套件(Biotium#31060)
  • Clariostar Microplate Reader(B德赢vwin官网客服MG Labtech)
  • 黑色,96孔板(Costar)
  • 黑色,384孔板(康宁)

使用1x Accublue制备标准曲线TM值Nextedgen缓冲液和高灵敏度DSDNA标准(10ng /μl),随着试剂盒提供。对于使用96孔板的测试,可以从3000〜1 pg中制备DSDNA稀释液。在384孔板中显示测定性能,平板DSDNA稀释液范围为750至0.25pg。


使用96孔板的测定如Biotium指令中所述进行。


使用384孔板的测定如下由以下修正阳离子进行。对于一式三份样品和缓冲填空,将50μl加工溶液加入到孔中,然后加入2.5μl变化的浓度为标准曲线或坯料缓冲液。使用Clariostar测试协议读取孵育板后,具有以下设置:


仪器设置

视镜设置 荧光强度,顶部光学
单色器设置: 激励: 467-15
二向西: 487.2(自动)
排放: 510 - 20
在阅读前焦点高度和增益调整
通用设置 建立时间:0.2秒(96孔);0.1 s(384孔)
40倍闪烁

成绩与讨论

前一个比较的Fl荧光花青染料表明AccublueTM值nextgen从5到5000 pg的线性1。我们的结果(图2)表明在1到3000 pg之间线性检测,与试剂盒文献一致。

图3检查了图2中所示的相同数据集,但仅使用所用的6个最低浓度的DNA。这提供了在低浓度下测定线性度的更好升高。

此外,先前的结果表明AccuBlueTM值NextGen使用公式的50 pg1的检测限(LOD)限制:


lod = x提单+ kσ提单


其中x提单是空白的平均值,σ提单为空白标准差,k为选择为3的数值置信因子。使用相同的公式,我们计算出LOD为接近4 pg,我们的96孔试验。


接下来,我们试图研究在384孔板上测量同样的实验的适用性。同样,在这个场景中,我们看到测试在750到0.25 pg的整个测试范围内是线性的(图4)。最后,我们能够计算出384孔测试的LOD为0.309 pg。

结论

Clariostar板读数器具有所需的灵敏度,可以实现Accublue的最佳性能TM值NextGen DSDNA量化套件。我们在测试的所有DNA浓度上获得了优异的线性,并且观察到比以前报道的更好的LOD值。性能延伸到384个孔板,计算的LOD甚至比96孔板更好。因此,这种组合允许在DNA的量化中具有出色的敏感性和在需要时保护样品的能力。


参考资料

1. Bruijns,B.B.等。(2016)。荧光花青染料用于少量DSDNA的量化。肛门。生物学习。511,74-79。

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