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用BMG LABTECH酶标仪荧光测定泥炭的胞外酶活性德赢vwin官网客服

SAF Bonnett R. Leah E. Maltby 利物浦大学可持续水资源研究所 09/2008
  • 荧光法测定泥炭胞外酶活性
  • 甲基伞形酮(MUF)及其衍生物作为底物
  • 96孔格式的快速测量使用BMG LABTECH microplate阅读器德赢vwin官网客服

表的内容

介绍

泥炭地生态系统代表了全球重要的碳储量(C),这是由于受到抑制的微生物分解所导致的有机质历史积累。分解受到植物和微生物群落产生的细胞外酶的限制,这些酶的功能独立于微生物群落。因此,泥炭地生态系统中碳的储存部分受到决定细胞外酶活性的环境因素的调节。因此,了解环境控制和调节细胞外酶活性的过程对于决定泥炭地生态系统中碳的命运至关重要。在这里,我们介绍了一种使用BMG LABTECH酶标仪测量泥炭中潜在的细胞外酶活性的方法的结果。德赢vwin官网客服该测定基于使用荧光甲基伞花酰基(MUF)底物,它在酶裂解时发出荧光,允许测量产品的数量。


材料与方法

  • 黑色96孔微孔板,f型底,格雷纳生物一号
  • MUF和MUF底物,Sigma-Aldrich
  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板阅读器

从英国达勒姆兰登穆尔收集泥炭样品,以确定甲基伞蕨基(MUF)底物的浓度,并将其添加到泥炭溶液中,以达到酶“活性位点”饱和和最佳的实验孵育时间。


水解酶β葡糖苷酶、cellobiohydrolase N-acetylglucosaminidase(或几丁质酶)测定使用MUF人工基质3(见表1)。对于每个泥炭复制样品,10立方厘米的泥炭是放置在一个50毫升离心瓶和去离子水加起来50毫升。用手摇晃小瓶30秒,再用涡流搅拌30秒。用锯断的吸管头,将0.75 mL泥炭浆放入1.7 mL离心瓶中。小瓶中加入0.75 mL MUF底物,在野外温度下孵育1小时。样品以12,000 rpm离心5分钟,将300 μL的上清转移到平板的孔中。在330 nm的激发波长和450 nm的发射波长下,用BMG LA德赢vwin官网客服BTECH酶标仪检测荧光。利用甲基伞毛酮(MUF)的标准校准曲线,从荧光单位测定酶活性,并表示为MUF的产量(μmol MUF / g-1干泥炭重量/ min-1)。在含泥炭化合物的水体中,荧光猝灭是一种降低荧光发射强度的潜在干扰过程。将MUF标准品溶解在150 μL离心泥炭浆中,每个泥炭重复淬灭后,标准校正曲线得到了解释。

表1:酶和酶MUF底物。

MUF衬底 反应
Cellobiohydrolase MUF -β-Dcellobioside 纤维素聚合物成二聚体
β葡糖苷酶 MUF -β-Dglucopyranoside 纤维素二聚体转化为单体
几丁质酶 MUF-N-acetyl -β-Dglucosaminide 甲壳素对乙酰氨基葡萄糖

在0 ~ 500 μM的底物浓度范围内进行上述实验,以确定最佳底物浓度。使用最佳底物浓度,然后将样品孵育不同的时间,以确定最佳的试验孵育长度。


结果与讨论

图1显示了增加底物浓度对纤维生物水解酶活性的影响。活性遵循Michaelis-Menten动力学,在约200 μM的底物达到饱和。

其中一个重复在100 μM底物处表现出底物抑制,导致在100 μM底物处的相对标准偏差为85%。这主要是由于被分析泥炭块内酶活性的空间变化,而不是分析变化。


图2显示了增加底物浓度对β-葡萄糖苷酶活性的影响。活性遵循Michaelis-Menten动力学,在约200 μM的底物达到饱和。其中一个重复在100 μM底物处表现出底物抑制,导致在100 μM底物处的相对标准偏差为91%。

图3显示了增加底物浓度对几丁质酶活性的影响。活性遵循Michealis-Menten动力学,在大约300 μM的底物达到饱和。

图4显示了泥炭对荧光的显著猝灭作用。

使用纤维生物水解酶、β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的最佳底物浓度进行的培养过程显示,1小时是反应速率保持线性的最大时间(数据未显示)。


结论

胞外酶β-葡萄糖苷酶、纤维素生物水解酶和n -乙酰葡萄糖苷酶分别在200 μM、200 μM和300 μM MUF达到底物饱和。测得的酶活性是线性的,长达120分钟,尽管60分钟的培养时间被选择为未来的应用,以减少重复之间的差异。一个重复显示底物抑制β-葡萄糖苷酶和纤维素生物水解酶测定。


结果表明,利用BMG LABTECH酶标仪可以在短时间内低成本地测定泥炭中潜在的胞外酶活性。德赢vwin官网客服

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