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基于freet筛选Gαi1蛋白/GoLoco相互作用的潜在调节剂

Stephanie Q. Hutsell Adam J. Kimple David P. Siderovski 北卡罗来纳大学 09/2009
  • 基于CFP-YFP FRET的测定用于筛选Gα的潜在抑制剂I1/ goloco互动
  • G蛋白/古典蛋白质相互作用的抑制剂是推定的药理学工具
  • 的POLARstar®Omega允许快速筛选和简单的数据评估

介绍

许多细胞外信号,包括激素,神经递质和生长因子,通过结合七跨膜结构域(7Tm)受体的细胞外部,其与细胞内异映酰胺G蛋白结合而在细胞内部分中继。受刺激的G蛋白偶联受体(GPCR)通过激活异映离蛋白(Gα)的α亚基来传播细胞外信号,当Gα交换GTP时发生的GTP。Gα亚基也由含有Goloco基序的蛋白质系列调节,其用于通过Gα亚基抑制GDP的GDP交换。因此,G蛋白/戈机组相互作用是一种有吸引力的药理学靶标,因为它用作下游GPCR信号传导的调节点。

目前,没有Gα/ goloco相互作用的小分子抑制剂可用于研究。虽然目前缺乏抑制剂的最近发现的蛋白质,但Goloco抑制剂的潜在应用是显着的。将现有的GPCR激动剂与特定的Goloco基序抑制剂组合可以协同增加现有药物的特异性,并用作有用的化学探针。


为了鉴定和评估Gα/ goloco相互作用的潜在调节剂,使用BMG Labtech的Polarstar Omega筛选推定的抑制剂在FRET(荧光/Förster共振能量转移)测定中。德赢vwin官网客服


测定原则

地面态GαI1绑定GDP。Goloco主题选择性地识别GαI1(GDP)并以纳摩尔亲和力结合。在一项基于FRET的测定Gα/GoLoco相互作用的试验中,FRET与CFP-Gα合作I1·GDP和YFP-GOLOCO在与CFP-Gα的非相互作用状态相比时彼此绑定时显着增加(530/485nm)褶皱比率I1(采用模拟GTP水解过渡态的四氟化铝形成)。


这种相互作用的抑制剂可能扰乱或取代核苷酸从Gα结合袋或它可以封闭GoLoco基序结合表面,从而阻止蛋白/蛋白相互作用。当Gα和GoLoco不再相互作用时,(530/485 nm) FRET比减小(图1)。


材料与方法

  • 黑色聚苯乙烯96孔板,康宁
  • YFP:PEYFP-C1开放阅读框架(ORF),BD Biosciences Clontech的氨基酸1-237
  • CFP:PECFP-C1 ORF的氨基酸1-239,BD Biosciences Clontech
  • Polartar Omega,BM德赢vwin官网客服G Labtech

RGS12Gα·GDP结合区域(Goloco MOTIF,AA 1187-1221)作为具有黄色荧光蛋白(YFP)的荧光嵌合品制备。将化合物滴定为优化的YFP-RGS12Goloco和Cyan荧光蛋白标记的GαI1(CFPGα.I1)确认抑制剂活动。地面态Gα.I1是GDP结合,Goloco基序容易粘合,从而产生来自非直接激发荧光团的FRET测定中的较高发射比。在模拟的GTP水解转变状态下,通过铝四氟化铝(表示amf)的结合产生,GαI1/ goloco相互作用不会发生。这是不直接激发荧光团排放与直接激发荧光团排放的未直接激发荧光团排放的荧光比的降低显而易见的。


对于FRET测量,POLATAR OMEGA与针对CFP / YFP FRET优化的过滤器一起使用。使用具有422nm的波长和530nm和485nm的双发射波长滤波器的励磁滤波器。仪器设置可以在下面找到。


仪器设置

定位延迟: 0.2秒
测试开始时间: 0.0秒
每孔闪光数量: 10
多合理数量: 1

同时激活双发射(仅在Clariostar和FluoStar Omega上提供的顺序测量)

励磁过滤器: 422 nm.
发射过滤器: 530海里
发射B过滤器: 485海里

FRET对(100nm CFP-GαI1缓冲液(GDP或AMF缓冲液)中的100nm YFP-RGS12Goloco在重复的60mL体积中等来,随着非标记竞争对手的增加。立即读取板,使用MARS数据分析软件确定的FRET比率(530/485)。


GDP缓冲液:10毫米Hepes pH 7.4, 150毫米NaCl, 0.0005% NP40替代,100毫米GDP, 50毫米EDTA

AMF缓冲液:10 mm HEPES pH 7.4,150mM NaCl,0.0005%NP40替代,100 mm GDP,50 mm EDTA,10 mm MgCL2,10毫米NAF,30毫米ALCL3.


成绩与讨论

g蛋白/GoLoco相互作用依赖于g蛋白的核苷酸结合状态。这种相互作用发生在g蛋白的GDP结合态,而不是GTP模拟水解态(AMF)。图2显示了两种缓冲液中不同浓度未标记竞争对手Gα的FRET比值I1

当反应体积为60μL时,获得Z'值0.853。测定系统还向DMSO(高达5%),常用的小分子筛选的常用溶剂(图3)展示了鲁棒耐受性(图3)。

基于CFP/YFP FRET的检测方法是一种稳健的检测方法,用于57个化合物的中通量小分子筛选(图4)。

结论

结果表明,基于CFP-YFP FRET的测定是一种稳健的测定,可容忍经常用于溶解小分子的浓度的DMSO。在低体积仅为60μl的低0.853的非常好的Z'值表明了在384孔格式下进行测定的可能性。Polar Star Omega被证明是一种可靠且坚固的仪器,用于执行基于FRET的测量。使用MARS数据分析软件,FRET比率和Z'值自动计算快速高效的评估。

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