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FRET传感器评估在经历低氧气条件的活植物中的ATP水平

Stephan Wagner (1,2) Philippe Fuchs (1,2) Thomas nietzsche (1,2) Marlene Elsässer (1,2) Markus Schwarzländer (1,2) (1)德国Münster大学植物生物学和生物技术研究所(2)德国波恩大学作物科学与资源保护研究所(INRES) 02/2018
  • 遗传编码传感器ATEAM监测器(亚)细胞MGATP水平体内在实时
  • Clariostar.®酶标仪可以记录植物细胞质中MgATP的动态变化,例如缺氧时
  • 低氧胁迫导致活植物中细胞MgATP池的枯竭

表的内容

介绍

为了生存作为无梗死生物,植物需要不断调整他们的新陈代谢。植物的洪水是普遍的,并且具有严重的代谢后果,因为它限制了氧气的细胞供应来驱除呼吸,从而产生ATP的产生。淹没适应通常涉及代谢对规避缺氧的激烈改变,并保持初级代谢和ATP供应。我们最近建立了使用遗传编码的蛋白质传感器(Ateam1.03-Nd / Na,参见参考文献1)来评估模型植物中的MgATP动态拟南芥蒂利亚纳。该系统允许可靠地分析MGATP中的变化体内实时,并提供新的手柄,以研究植物细胞的低氧的能量后果。


测定原理

ATeam是一种基因编码Förster共振能量转移(FRET)为基础的蛋白质传感器,可逆结合MgATP1。MgATP结合诱导了MgATP结合域的结构变化,并导致更高效的荧光荧光素(FRET)从蓝色荧光团mseCFP (CFP)到黄色荧光团cp173-mVenus (Venus)。(图1)。因此,高金星/CFP荧光发射比表明高MgATP水平,反之亦然(图1B)。在语言中,teamam可以稳定、连续、高水平地表达拟南芥淹没植物和低氧胁迫可以同时限制它们的氧气供应(图1C)。

材料与方法

  • CLARIOstar酶标仪(BMG LABTECH)德赢vwin官网客服
  • 透明的Microtest板96井,F(Sarstedt#82.1581)
  • QPCR透明 - QPCR(VWR#391-1258)
  • 测定培养基(10 mm MES,pH 5.8,10 mm cacl2,10 mm mgcl2,5 mm kcl)

实验程序
拟南芥幼苗在透明的96孔MICREST板上浸没在测定培养基中。井是未密封的(控制条件,允许与大气氧气的培养基一起重新补充)或用透明的电缆密封以限制用氧气的测定培养基重新补充。记录了ATEAM FOR荧光的同时 - 除了激发粉碎之外 - 将板保持在黑暗中以通过光合作用抑制氧气进化。

仪器设置

视镜设置 荧光强度,平板模式动力学,顶部光学
多色数2
单色仪设置 CFP(1250年获得)
励磁435 - 20海里
二向459.5
排放483-18
金星(增益1200)
励磁435 - 20海里
二向488.8
排放539 - 13
扫描 轨道平均直径为3毫米
常规设置 每周期闪现次数50次
建立时间0.2 s
动态设置 循环次数800
循环时间180 s
摇晃 在每个循环前,以400 RPM进行10秒的双轨道振荡

结果与讨论

暴露于低氧应激的拟南芥幼苗显示逐渐降低胞质溶胶中的金螺/ CFP比(图2a),而在测定培养基中浸没的幼苗几乎保持几乎恒定,但未密封以允许氧气补给,除了初始下降幼苗浸泡后立即(图2B)。这表明MGATP在氧气限制条件下向细胞溶溶胶供应不能够平衡细胞溶质ATP消耗。在16小时后,在井后的井中的开封导致MgATP水平的回收率通过幼苗重新氧化,证明了ATEAM读数的可逆性(图2C)。Individual emission intensity plots of Venus and CFP highlight a key advantage of ratiometric FRET-based protein sensors over intensiometric sensors and/or dyes: while in Figure 2B individual fluorophore intensities vary (e.g., through sample movement), the Venus/CFP ratio remains relatively stable. A true difference in MgATP binding as seen in Figure 2A is, in contrast, characterized through the antiparallel behaviour of both fluorophore emission intensities as a result of博纳菲德烦恼。

结论

ClarioStar酶标读数允许读取在暴露于天然存在的应力条件(例如,缺氧作为浸没应力的标志)的植物中读取遗传编码的蛋白质传感器(例如,ateam1.03-nd / na)的Fororcescess。


参考文献

1.伊玛拉,H等。(2009)在具有流荧光共振能量转移的遗传编码指标的单一活细胞内的ATP水平的可视化。Proc。Natl。阿卡。SCI。美国106:15651-15656。
2. de col,v等人。(2017)生物植物细胞的ATP感应揭示了能量生理学的组织梯度和应力动态。Elife 6:E26770。

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