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使用Cisbio的cAMP和IP1 HTRF HTplex细胞为基础的试验来测量GPCR激活

劳伦斯·杰奎玛特(1)EJ戴尔(2) (1) Cisbio (2) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH 10/2010
  • Lumi4-TbTMHTRF®该技术用于通过绿色读数(520 nm)测量cAMP和通过红色读数(665 nm)测量IP1
  • 在CHO细胞中检测抗利尿激素-2受体的激活

表的内容

介绍

GPCRs通过两条主要信号通路在细胞内传递信息:调节cAMP水平和细胞内Ca的增加2 +由肌醇1,4,5 -三磷酸(IP3)触发。这些信号通路被受体相关的特定G蛋白激活。g或Gi偶联受体的激活分别导致cAMP水平的增加或减少。Gq偶联受体的激活激活了磷脂酶C (PLC)并触发了肌醇磷酸(IP)级联反应(图1)。


Cisbio Bioassays开发了能够监测Gs, Gi和Gq偶联受体激活的检测试剂盒,使用他们的新一代Lumi4-Tb™TR-FRET密码酯。这种化学反应允许使用两种不同的受体,一种绿色染料(λ = 520 nm)和一种红色染料(λ = 665 nm),在一口井中检测两种事件。Cisbio的Tag-lite也使用了同样的化学成分®技术。


IP-One和cAMP实验在来自BMG LABTECH的HTS微孔板阅读器上进行,同时使用双发射检测。德赢vwin官网客服有了这个独特的特性,在双发射分析中,板只读取一次,从而减少了时间和变异性。

测定原理

IP-One和cAMP HTplexTMassay是一种竞争性免疫检测方法,使用两种标记为Lumi4-Tb的抗体TM(anti-cAMP Cryptate和anti-IP1 Cryptate作为供体)和两个受体(camp -绿色染料和ip1 -红色染料)。在非激活状态下,红色和绿色的排放都可以看到一个高TR-FRET信号。由于GPCR激活产生cAMP或IP1,示踪剂green-cAMP或red-IP1将与Tb-cryptate抗体解耦,从而导致TR-FRET信号降低。特定的发射信号与标准品或细胞裂解液中cAMP和IP1的浓度成反比。

材料与方法

  • 来自Cisbio Bioassays的IP-One和cAMP试剂
  • 384孔格式的白色微孔板
  • 来自BMG实验室的多检测微孔板阅读器德赢vwin官网客服

细胞的准备

将CHO-V2R细胞(稳定转染血管加压素受体)在F12培养基中培养,然后稀释至100万细胞/mL浓度(存活率:96.3%)。每孔分配30 μL,每孔3万个细胞。平板在37°C孵育过夜。抽吸细胞上清(细胞塌陷至井底),立即更换10 μL的刺激缓冲液。


标准曲线:添加20μL稀释标准,5μL cAMP-green染料/ IP1-red染料和5μL cAMP-Cryptate / IP1-Cryptate,然后孵化1小时在rt,抗利尿激素剂量反应:加10μL刺激缓冲区,10μL抗利尿激素(4 14稀释:从0到打败米),1小时刺激在37°C。然后加入5 μL cAMP-green /IP1-red染料,5 μL cAMP-Cryptate/ IP1-Cryptate孵育1小时。Z '计算:加入10 μL刺激缓冲液(基础)或10 μL加压素10 μM, 37℃刺激1小时。然后加入5 μL cAMP-green /IP1-red染料,5 μL cAMP-Cryptate/IP1-Cryptate孵育1小时。


仪器的设置
特定的HTRF兼容滤波器组/光模块,一个用于红色,一个用于绿色。积分起始= 60 μs,积分时间= 400 μs。闪号= 300(如果速度很重要,可以用100闪)。读板两次。如果仪器配有紫外线激光器,建议使用7个闪光灯。

数据简化
Cisbio拥有一项比率测量专利,使用供体和受体的发射波长(美国专利5,527,684*和国外等效)来校正井间变化和信号猝灭。620nm处的放射物(供体)被用作内参,而665nm和520 nm处的放射物(受体)被用作评估生物反应的指标。计算了荧光强度的比率665/620和520/620(受体/供体),以检测每一个单独的相互作用。

结果与讨论

图2显示了使用cAMP和IP1标准的校准曲线。两条曲线都给出了期望的EC50值。

这张图显示了两个信号事件的发生:在较低浓度的后叶加压素下,可能通过激活内源性V1受体产生初始cAMP (Gs)反应;在更高浓度下,通过激活转染的V2受体,可以延迟IP3 (Gq)反应(通过IP1积累测量)。

在图3中,以剂量反应方式用加压素激活CHO-V2R细胞后,测定了cAMP和IP1。


最后,通过Z撇号计算测量的分析的稳健性(图4)表明,这两个信号都大大高于高温热成像分析的可靠性范围,给出Z '值> 0.75。

结论

的HTplexTMCisbio的检测方法可以通过测量Gai/s和Gaq的第二信使反应cAMP和IP3(通过IP1)来评估两种不同的GPCR信号通路。在此,HTplexTM采用剂量反应法评价加压素对CHO-V2R细胞的剂量效应。根据测量,在较低浓度时存在一个初始cAMP反应,在较高浓度时存在一个潜在的IP1积累。这个应用笔记的概念可以扩展到Cisbio的附赠HTRF®化学、Tag-lite®它使用同样的Lumi4-TbTM密码和相同的红色和绿色受体。

HTplex是Cisbio的注册商标。

HTRF是Cisbio的注册商标。

Lumi4是Lumiphore Inc.的商标。

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