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用装有ACU的微孔板阅读器培养弯曲杆菌

R.D. Haigh J.M. Ketley 莱斯特大学遗传学系 08/2011
  • 使用微丙烯酸氢化物的生长弯曲杆菌作为一个模型
  • 试管培养箱与装有ACU的仪器中96孔板生长的比较
  • 独立氧和二氧化碳调节允许不同细胞类型的最佳生长条件

介绍

弯曲杆菌是革兰阴性微嗜血硅生物,是哺乳动物和鸟类的常见共生,是全球人体细菌肠炎中最常见的均衡剂之一。人类感染经常与煮熟的家禽的消耗有关,并且通常在少数病例中可以是自我限制的,导致严重的并发症如Puillain-Barre综合征。虽然在肠道患者粪便样本中观察到类似的螺旋形生物多年,但弯曲杆菌空肠直到20世纪70年代,新的培养方法被开发出来,才与疾病有了适当的联系。c .空肠具有相当严格的增长要求,即;富含营养肉汤,温度为37-42°C,微苯胺条件,即氧气降低至5-8%,二氧化碳升高至10%。有人建议,这些条件密切地模仿了细菌在野外适应的禽类宿主的肠道中的条件。

历史上在我们的实验室Campylobacter Jejuni.生长研究在42°C 7% O的15 mL试管中进行振荡液体培养2和10%的公司2在可变气氛培养箱(虚空)柜中;然后将这些暂时从培养箱中移除,以定期采用光学密度读数。这种方法有几个限制:样品必须在采样所花费的时间内暴露于实验室大气条件和温度;缓慢的倍增时间c .空肠意味着需要在24小时内采取理想的样品;并且存在对样品数量的物理限制,并重新复制,可以在虚空中轻松处理。


这里描述的是比较c .空肠使用传统的管道方法在vain中摇动的传统方法进行,其使用与配备有大气控制单元(ACU)的BMG Labtech板读数器以96个孔微孔板格式完成,以独立控制氧气和二氧化碳。德赢vwin官网客服


材料与方法

  • 透明平底96孔组织培养板(Nunc)
  • 透气预刺穿封口机(FluidX)
  • Microplate reader来自BMG 德赢vwin官网客服LABTECH,带有大气控制单元(ACU)

所有弯曲杆菌培养物在Mueller Hinton broth (MHB)或Mueller Hinton agar (MHA) plates (Oxoid)上生长。最终添加的抗生素浓度为:万古霉素,10 μg/mL;trimethoprin 5μg / mL。细菌培养在无菌的康宁15ml聚丙烯试管中培养。


Vain方法:
菌株从-80°C冷冻储存中恢复到含有甲氧苄青霉素和万古霉素(VT)的MHA板上,并在徒劳中生长一夜(Whitley VA1000工作站;Don Whitley,英国)在42°C, 10%的公司27%o2。取有生长的板拭子,重新镀到新鲜的MHA板上,根据需要含有适当的抗生素,然后再徒劳地孵育一夜。用这些平板培养物接种5ml MHB (+VT)发酵剂,然后用震荡(50 rpm)徒劳培养一夜。测定每个发酵剂的光密度(600 nm),然后用新鲜MHB+VT稀释,得到最终OD值6000.01(通常为50-80倍稀释)。


每株菌配制3次8 mL的培养液,15 mL试管,50 rpm振荡。每隔几小时,将培养物从空洞中取出,取一小块样品,用试管和分光光度计测定600 nm处的光密度。

使用带大气控德赢vwin官网客服制单元的BMG LABTECH microplate阅读器:
使用与上述相同的方法在Vain中产生起始培养物,并且在新鲜MHB + VT中稀释菌株以使培养物与OD6000.01。将多个200μl等分试样的稀释培养物接种到96孔微孔板的个体孔中 - 对于这些实验,我们使用6个技术复制和每种菌株的两个MHB坯料。然后用气体可渗透的预刺穿密封件密封板,以便将刺穿的狭缝远离孔的中心定位以避免干扰吸收测量。


然后平板在42°C的酶标仪中孵育,设置大气控制单元独立控制O2到7%和CO2到10%。氧自由氮和二氧化碳瓶在30psi下连接。测量600nm的吸光度(20次闪光/循环),为30分钟的40分钟,在测量之间不断摇动(双轨道),在500rpm之间的持续振动(双轨道)。

成绩与讨论

典型生长曲线弯曲杆菌在徒劳的管中生长如图1所示。

生长通常在呈指数上生长到OD之前呈现4-5小时的滞后阶段600最大的0.5-0.6取决于应变。增长弯曲杆菌96孔板格式的菌株在微孔板读取器中孵育,具有大气控制单元如图2所示。

微孔板生长的滞后期似乎比试管生长的稍长,但生长曲线非常相似,24小时后达到的最大生长水平是相似的。


编程的自动数据收集提供了在较长时期测量增长曲线的能力,常规间隔具有读数。这产生了在比较响应中的微妙之处时具有更重要的增长曲线。

控制两种气体的能力独立地提供了快速且简单地在不同条件下测试生长的能力。此外不同的O.2和有限公司2可以为其他微生物设定浓度,沙门氏菌,奈梅里亚等等,而不需要改变气体或连接定制的混合气体。简单地以多平行方式执行和监测生长的能力,为我们提供了跨越一系列弯曲杆菌菌株分析多个突变体快速执行生长研究的能力。此外,增加的在不同氧化条件下工作的潜力将允许我们进行比较生长实验,这是我们之前由于多个用户在一个无用的柜子中受到限制而没有考虑到的。


结论

比较的增长弯曲杆菌在将管道中孵育的管中孵育至96个孔板中的那些,在微孔板读卡器中,具有大气控制清楚地表明,这种棘手的生物体的生长可以转移到96孔格式。通过设计BMG Labtech仪器提供温度控制并与大气控制单元一起振动,这使得德赢vwin官网客服这是简单的,便于对o的独立控制2和有限公司2在读者

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