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在pherstar上高速基于fret的SNP基因分型测量

弗兰卡·甘斯克(2) (1) Kbiosciences (2) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH 12/2014
  • 利用KASP进行基于FRET的SNP基因分型TM系统
  • 优化的双发射光模块
  • 测量速度和准确度的提高

介绍

单核苷酸多态性(SNP 's)已成为遗传研究领域的一个宝贵工具。他们被广泛应用于从药物遗传学到动物品种鉴定到疾病基因图谱的科学领域。由于它们易于测定和分析,它们是一种流行的选择遗传标记,然而许多标准测定法在高通量使用仍然相对昂贵。在这个应用笔记中,我们展示了pherstar的使用®用于SNP基因分型化学开发和高通量生产基因分型的多模式平板阅读器。KBiosciences公司(现为LGC公司)开发的KASP™系统用于评估pherstar的性能增强,使用BMG LABTECH公司开发的具有双发射的新型SNP基因分型专用光模块(图1)。使用两个光电倍增管可以提高准确性,并减少30%的读取时间。德赢vwin官网客服

材料与方法

所有材料均来自Sigma Aldrich,只有384孔和1536孔微孔板是在公司生产的(部件编号分别为Pro 384和1536)。寡核苷酸也来自德国的Operon。


使用的化学是KBiosciences专利系统,基于均相荧光共振能量转移(FRET)检测系统,使用等位基因特异性PCR。简单地说,为SNP的每个等位基因设计两个oligos。每一个寡核苷酸的尾部都有一个不同的18bp序列。反应中还包括Taq聚合酶,dNTPs,内标染料(罗丹明X, (Rox))和反向引物。


修改版本的Taq聚合酶不能扩展引物在他们的3′末端碱基不匹配。这是用来区分两个等位基因。反应是由两个新的荧光报告oligos的荧光产生的,包括在反应中。所有反应均在1µl(1536孔板)或2µl(384孔板)的体积下进行,并在Hydrocycler thermal cycler (KBiosciences, Basildon, UK)中进行热循环。液体处理使用Deerac赤道TMGX8 (Deerac流体,都柏林,爱尔兰)。


结果与讨论

基于SNP的基因分型本质上是一种定性技术,其结果是群集图。在PHERAstar评估的情况下,进行了初步评估,以确定阅读的最佳条件。在这一阶段,确定了增益、激励和发射滤波器的选择以及每孔闪烁数的影响。双发射模块提供了巨大的优势,读取内部标准(ROX)和等位基因特定染料(FAM和VIC)在一起。优化模块确定为:

FAM公司/火箭
485海里
EmissionA
610海里
EmissionB
520海里
维克/火箭
520海里
EmissionA
610海里
EmissionB
560海里

图2和图3显示了不同发射模块的测量结果。结果表明,使用双发射模组可以获得更清晰的团簇。

结论

在过去,pherstar一直能很好地执行这个应用程序,但是通过引入SDE模块,性能得到了进一步的显著提高。此外,双光模块在KBiosciences生产设施的实现导致了30%的吞吐量增加,因为每个井只需要读取两次(Fam/Rox,然后是Vic/Rox),而不是单独读取每个氟。


最后,我们注意到,自从双模块的实现,pherstar的误读率已经降低到一个水平,不再是可测量的。在初步评估后,整个PHERAstars生产基地在KBioscience设施已经升级为双模块。

背景

LGC的基因组部与KBioscience LGC联合宣布LGC的基因组部和KBioscience将共同创建一个市场领先的基因组服务和解决方案提供商。KBioscience LGC是一家国际科学公司,在分析、法医和诊断服务和参考标准方面处于市场领先地位。


关于KBioscience
KBioscience是一家总部位于英国的技术公司,专注于SNP基因分型化学和新型仪器。KBioscience成立于2002年,致力于开发激光焊接技术作为服务型科技公司在SNP基因分型市场的应用,开发了自己的SNP基因分型化学和新型仪器。

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