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在北极星Omega微孔板阅读器上开发的高通量、动态蛋白展开分析

强王Zoey Sharp Nicklas Waterhouse Matt Dominguez Elliott J. Stollar 东新墨西哥大学物理系 05/2016
  • 检测色氨酸FOR荧光用于两个互补蛋白展开测定
  • 注射时的读数和高频读数(每120毫秒)提供最大的信号保留

表的内容

介绍

为了理解蛋白质结构,动力学和能量学,显然必须了解蛋白质稳定性的蛋白质折叠的动力学。期望进行Φ-值分析,但收集这些分析的数据是费力的,在大多数情况下,该方法不适合高吞吐量。


在这里,我们描述了先前方法的适应性,使用Omega酶标仪来测量色氨酸(Trp)荧光。该方法还利用试剂注射技术开发了一种直接测量蛋白质展开率的技术。


测定原理

开发了两种测定方法。动力学蛋白展开测定(图1)通过将变性剂注入井中并监测内在色氨酸残留物的荧光发射来测量随时间展开的蛋白质。ω的测量特征点的注射允许保留最大信号信息量。

对于展开动力学常数大于0.01s的蛋白质1建立了一种有限的蛋白质水解测定方法。人工将不同浓度的胰蛋白酶或热溶酶添加到蛋白质中,随着时间的推移监测色氨酸荧光。

材料与方法

  • 96孔石英微孔板(Hellma)
  • Polartar Omega麦格板读卡器(BMG Labtech)德赢vwin官网客服

有关详细的实验程序,请参阅Wang等人。1。检测的蛋白包括AbpSH3(来自肌动蛋白结合蛋白1的src同源3结构域),以及该蛋白的突变体:AbpSH3 E7L、AbpSH3 V21K和AbpSH3 Triple,其中包含突变体E7L、V21K和N23G。随后,对AbpSH3 - ArkA(肌动蛋白调节激酶SH3结合肽A)杂交体HLL (hybrid long linker)进行了检测。

欧米茄仪器设置

动态蛋白展开试验
测量类型: fi(底部)
测量模式: 好模式
循环数量: 1000
周期: 120毫秒
过滤器: 280-10 / em330 -10
获得: 1400
注入体积: 4.0 - 92.0 μl (4.0 μl增量)

有限的蛋白水解展开测定
测量类型: fi(底部)
测量模式: 板模式
循环数量: 1000
周期: 73秒
过滤器: 280-10 / em330 -10
获得: 1400

结果与讨论

使用Omega平板阅读器获得的野生型AbpSH3蛋白的代表性数据如图2所示。这些数据是在不同浓度的变性胍下生成的展开曲线。

从这些数据,可以确定展开的脚轮图(数据未示出),其允许确定表1中所示的展开常数。注意,确定对ABPSH3的值以及该蛋白质的突变形式近距离那些以前在文献中报道的人2、3。这表明该测定与停止流动方法相当。


表1:动力学展开数据汇总

K.exp (s。1) X 103. K.文学(S.1) X 103. mExp。(KJ MOL.1m1 m文学(kJ摩尔1m1
AbpSH3 WT 71.0±5.4 65.8±5.3 0.92±0.06 0.83±0.04
AbpSH3 E7L 7.2±0.5 4.8±1.6 1.09±0.01 0.96±0.10
ABPSH3 V21K. 48.5±10.5 44.8±4.3 * 0.69±0.05 0.56±0.03 *
ABPSH3 TRI。 2.9±0.6 4.7±3.6 1.01±0.01 0.70±0.20
高级语言 4.2±0.8 N / A. 1.07±0.01 N / A.

*实验使用尿素而不是胍作为变性剂


图3显示了使用HLL在胰蛋白酶的存在下显示出展开监测的HLL的有限蛋白水解展开测定的结果。

使用MICHAELIS-MENTEN型式等式进行了此数据,产生0.0023s的展开常数1胰蛋白酶。请注意,该值为0.0042s1如表1所示。从这些结果中,我们得出结论,这种互补方法是快速展开蛋白质的可行替代方案。因此,化学变性和有限的蛋白水解方法都提供可靠的高通量动力蛋白在ω上展开测量。


结论

动力学蛋白展开测定与先前描述的方法有几个优点。首先,它具有较短的测定时间,这意味着可以监测相对较快地展开的蛋白质。在该测定中每120毫秒读读物的能力是进一步的好处。这里描述的两种测定可以在相对低的体积(100μl)处,以保护样品的蛋白质浓度。


参考文献

1.王强等(2016)开发和应用高通量蛋白展开动力学分析PLoS ONE 11 (1):e0146232。
2.黄晓明(2000)Abp1p SH3结构域的超稳定突变体的设计。蛋白质科学9(12):2457- 2469。

3. Maxwell Kl等。(2005)蛋白质折叠:定义“标准”一组实验条件和两种状态蛋白质SCI的初步动力学数据集。14(3):602-616。

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