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使用BMG Labtech Microplater Reader的蛋白质稳定性的高通量测量德赢vwin官网客服

Jean P. Aucamp Ana M. Cosme Gary J. Lye Paul A. Dalby 伦敦大学学院生物化学工程系 06/2005
  • 可负担得起的蛋白质稳定性的高通量筛选方法
  • 通过测量色氨酸荧光来展开为细胞色素C和BSA观察到的过渡
  • 在定向进化、蛋白质组学和治疗性蛋白质配方等领域的潜在应用

介绍

蛋白质稳定性的测定对于阐明蛋白质的功能至关重要在活的有机体内。例如,治疗性蛋白需要最佳的配方来提高保质期,高通量稳定性测量可以快速检测许多辅料组合对蛋白质稳定性的影响。


蛋白质稳定性的测量通常是通过监测蛋白质聚集或在高温孵育后的残留活性间接获得的。这两种筛选方法都依赖于蛋白质展开时的不可逆失活。虽然这些间接筛选已经成功应用,但它们可能不容易区分当回到活性测定条件时自动折叠的蛋白质的稳定性差异。

通过用化学变性剂或温度偏移测量它们在扰动时测量其色氨酸荧光,可以观察到蛋白质的展开过渡。在这里,我们描述了使用BMG Labtech的微孔板读取器与滴定注射器泵的展开程序。德赢vwin官网客服通过340nm的色氨酸荧光监测蛋白质展开过渡,并使用牛和马细胞色素C(Cyt C)的评估,以及用各种量的棕榈酸稳定的牛血清白蛋白(BSA)。展开由Denaturant的连续添加到单孔中产生的曲线,允许高通量稳定性筛选能够识别蛋白质变体,其展开中点差异为0.15μAddurant浓度或更大。这种方法适用于筛选大量蛋白质或配方条件,以对蛋白质稳定性的顺序进行排序。


材料与方法

稳定性测量
使用具有一个注射器的荧光BMG Labtech微孔板读卡器,在F型,聚苯乙烯,96孔微孔板(Greiner BiOne)中测量所有蛋白质展开过渡。德赢vwin官网客服通过在280nm的激发激发的激发激发,通过固有色氨酸荧光通过固有色氨酸荧光监测蛋白质展开。

以含20 μg cyt c或40 μg BSA的50 μL蛋白溶液为对照液,连续加入变性缓冲液,得到蛋白展开曲线。每次加入后,用350转的轨道振荡进行30秒的混合,并在测量之前进行15分钟的平衡。

成绩与讨论

优化每个添加变性剂的孵育时间,以确保Cyt C和BSA展开达到平衡。凭经验鉴定,注射之间15分钟足以使CYT C和BSA完全平衡,导致连续添加实验,适用于25个变性浓度最多10小时。从牛和马心脏的Cyt C的构象过渡曲线被绘制为平行进行的九次重复(图1)。

转换中点,C1/2和MG值(用非线性拟合估计)总结在表1中。报告的稳定值是九个并行稳定性分析中的每一个的估计的平均值。
使用不同的储备和蛋白质溶液(表1),从单独的几天进行的三个单独的实验计算了运行间变异性。蛋白质的中间点可以估计为±0.15μm的精度,但Mg的值显着高估。


表1:氧化细胞色素C(CYT C)的稳定性数据概述

C1/2(m) mG(kcal / mol) ΔG(kcal / mol) %简历
C1/2 mG ΔG
2.50 (0.08)一个 6.19(1.83)一个 14.26(4.60)一个 2.25B. 22.66B. 49.09B.
2.67 (0.14)一个 4.72(1.19)一个 11.83(1.35)一个 4.73B. 4.01B. 6.56B.

从9个数据集计算出的总体标准差。

b从27个数据集计算出的变异百分比系数。

用C对蛋白质稳定性进行排序的能力1/2足以用于定向的演化屏幕,其中关键要求是发现抗蚀剂在生物反应器所需的条件下抵抗的酶。它对治疗制剂也是有用的,其中期望赋形剂的组合,以改善蛋白质的抗性展开。Mg值计算的大误差(6.2±1.8 kcal·mol-1·m-1用于牛cyt c)是确定前和展开后基线的不准确性的结果。各种BSA的展开曲线:使用GDNHCL作为变性剂的棕榈酸氏制剂如变,如图2所示。

从简单的双态展开曲线的偏离程度来看,高棕榈酸盐浓度下BSA的展开曲线至少存在一种中间体。这种中间产物归因于蛋白质较不稳定的c端部分的早期展开。脂肪酸分子部分稳定了中间体,增加了尿素诱导展开的中点。


采用3种简单的数值方法来量化不同牛血清白蛋白制剂的稳定性:i)将展开的数据集拟合为两态转换模型,计算出全局C的近似估计1/2-值;ii)使用梯形规则计算展开曲线以下的区域;III)使用由任意设定值的两个数据点定义的线性方程来计算60%或70%展开的变性浓度。图3描绘了使用这些技术的稳定性估计。

所有这三种数值方法都可以确定在四种棕榈酸盐浓度下BSA稳定的顺序。有趣的是,微孔板GdnHCl中牛血清白蛋白的荧光展开曲线(图2)也可以检测到当三个棕榈酸分子与每个牛血清白蛋白分子结合时出现的中间态,即在高棕榈酸浓度下。


结论

我们已经开发并表征了一种实惠的高通量筛选方法,用于直接测量市售微孔板读卡器中蛋白质的稳定性。该方法通过自动培育的自然剂和测量色氨酸荧光的改变产生微孔中的展开曲线。当筛选C的变化时,该方法很有用1/2与合适的数值数据分析技术相结合,它可以成为筛选突变体生物催化剂文库以提高稳定性的有力工具。

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