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使用FLUOSTAR OMEGA对抗真菌活性和生长动力学进行双吞吐量的方法

Gordon Ramage Ryan Quinn Steve Milligan 格拉斯哥牙科学院牙科学院格拉斯哥大学 03/2009
  • 茶树油对群体测量酵母生长的影响®欧米茄
  • 抗真菌剂的最小抑制浓度测定的动力学
  • 生长和抑制作用可以串联评估

介绍

高通量测试是对临床重要病原体测试潜在抗菌分子的面板的基本要求。考虑到有效抗微生物剂的感染性疾病和Dwwindling阿森纳,这尤为重要。因此,制药行业,商业实验室和独立大学研究人员需要敏感的工具,使它们能够从其所选分子中检测抗微生物活性。


目前的方法主要依赖于终点肉汤微量稀释或琼脂扩散来评估抗微生物活性。使用终点读数评估抗菌活性是困难的,因为这依赖于浊度的目视检查,并且与未处理的对照相比,微辐射板内的微量滴定板孔隙良好。尽管终点测定的吸光度可以读取分光光度法,但这并不能提供与抑制动力学有关的准确数据,这可能是由于增长速度缓慢而在许多情况下进行微妙的。例如,抗微生物活性可能受特定介质的生长速率影响,例如,Mueller Hinton Broth,不能通过端点视觉检查准确地评估它。因此,不可能对数据的准确解释。


本应用说明书中描述的实验方法旨在确定氟星Omega准确量化新型抗菌剂茶树油(TTO)对致病性酵母的抑制特性的能力念珠菌白葡萄酒。当存在已知的抗微生物剂两性霉素B存在时,结果与生长速率进行比较。


材料与方法

  • 透明聚苯乙烯96孔板(康宁)
  • Melaleuca alterifolia茶树油(Sigma-Aldrich)
  • Fluostar omega(B德赢vwin官网客服MG Labtech)
  • 两性霉素B (AMB [Sigma-Aldrich])

念珠菌白葡萄酒在37℃下在轨道振荡器上在酵母蛋白右旋糖葡萄糖(YPD)肉汤中繁殖过夜。将所得酵母悬浮液通过离心在PBS中洗涤并计数在血慢速度计中。酵母细胞标准化为约1×106每毫升细胞稀释100倍到新鲜的YPD肉汤中。然后在含有0.05% v/v Tween 80的YPD中制备TTO和AMB, TTO为0.01、0.05、0.1和0.5%,AMB为0.0002、0.0001、0.00005和0.000025% w/v。将酵母细胞稀释到每个TTO悬浮液中,最终浓度为1×104 cells/mL,然后将200 μL的体积分四次排列到96孔微量滴定板的相邻柱中。阴性对照不含任何试剂。平板被放置在荧光灯欧米茄内,培养箱预设为37°C。吸光度模式设置为550 nm读取,每次读取前轨道震动30秒。这是一个在24小时内进行48次单独测量的程序。


成绩与讨论

随着浓度的TTO相对于未处理的对照,观察到生长的显着降低(图1)。

此外,该数据表明剂量依赖性抑制特性,这是不可能区分从24个端点读取的。当与未处理的对照相比,当来自12小时和24小时的时间点的吸光度数据时,此时清楚地证明了(图2)。孵育12小时后,在测试的各种浓度之间观察到显着差异,而在24小时内孵育平均吸光度的差异是最小的。

在对新型抗真菌TTO进行研究之后,如上所述在不同浓度下所述添加良好描述的和有效的抗真菌剂AMB念珠菌白葡萄酒悬浮液(图3)。该数据显示,AMB在最高浓度(0.0002%)下表现出透明的抑制型材,增长率降低为0.0001%。然而,在所有其他浓度中检测到生长率类似于AMB游离细胞悬浮液,表明AMB的浓度在诱导细胞膜不稳定性方面是至关重要的。

总之,这些数据表明,抗真菌作用模式是白色念珠菌表现出的抑制和生长概况的重要决定因素。AMB是一种多烯抗真菌剂,通过与细胞膜中的麦角甾醇的特异性相互作用,破坏细胞膜,使细胞质成分泄漏,导致细胞死亡。也有人提出TTO作用于细胞膜,但由于TTO是由萜烯组成的复杂混合物,其具体作用方式尚不明确。

它可能以非特异性和浓度依赖性方式改变膜渗透性,从本文所述的实验中获得的生长动力学的模式证明。


结论

在本实验中,我们证明了最低抑制浓度测定可以使用氟星Omega评估,以提供敏感和准确的生长动力学分析,以证明微妙的剂量依赖性药物效应,否则使用端点读数会被忽略。这种筛选方法的好处是念珠菌白葡萄酒和其他致病微生物可以用不同的抗微生物剂和浓度进行测试。


此外,如果不同的荧光菌株可用,则可以在串联中评估混合微生物群的生长和抑制性能。

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