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使用BMG Labtech微孔板读卡器的蜂窝活力动态测量的高通量方法德赢vwin官网客服

Mark S. Chitolie Emil C. Toescu 伯明翰医学科学院 04/2008
  • 碘化丙啶(PI)法测定细胞活力
  • 超过24小时的动力学测量允许测定延迟时间和死亡率
  • BMG 德赢vwin官网客服Labtech酶标器读卡器用于长时间记录PI FORECACE

介绍

评估细胞活力的准确可靠方法是与细胞培养有关的任何工作的重要要求。除了对培养的基本监测的基本监测外,这包括药物毒性研究。目前,可以使用各种测定来评估基于各种不同的生物化学和分子原理的细胞活力。


通常,存在两种主要方式,其中细胞可以被定义为不可行的。如果细胞具有:(1)损伤的血浆膜或(2)已经失去了代谢功能。诸如台盼蓝和碘化丙锭的染料对等离子体膜不透水。


因此,只有细胞膜受损的细胞才会吸收这些类型的染料。鉴别受损质膜的另一种方法是检测细胞外培养基中的物质,而这些物质通常只在细胞的胞浆中发现。因此,它们一定是通过质膜渗漏到细胞外的。这种方法的一个例子是乳酸脱氢酶测定法,它检测细胞外培养基中的胞质酶(乳酸脱氢酶)。

本应用笔记中所述的工作是基于碘化丙啶(PI)测定的。这是一种非常有效的检测方法,可以在很长一段时间内动态测定其活性。这在研究各种物质的作用时非常有用,这些物质不一定对细胞有立即诱导作用。因此,这种方法能够识别任何延迟死亡,而当仅评估某一特定时间点的生存能力时,可能会遗漏这些死亡。此外,由于测量在很长一段时间(24小时)内是动态的,因此可以充分调查死亡发生的速率。在本实验中,我们描述了一种利用BMG LABTECH微孔板阅读器动态评估神经元死亡的高通量方法的进一步发展。德赢vwin官网客服


材料与方法

  • 黑色24孔板(Iwaki,Scienti Cu C实验室用品有限公司)
  • 碘化丙啶(PI, Sigma)
  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板阅读器

从产后Wistar大鼠(P5-8)获得小粒颗粒细胞,并以每孔280-300,000个细胞的电镀密度直接培养到24孔板上。用DH稀释PI2o浓度为5mg / ml,并以50μg/ ml的浓度为50μg/ ml(在被称为'Ctrl'的实验缓冲液中稀释)(由于它是光敏的光保护PI)。


BMG 德赢vwin官网客服Labtech酶标器读卡器被设定为FLOORESTECTOM模式,激发波长为544nm,发射波长为612nm。将来自每个孔的培养基除去并用500μl的PI-CTRL溶液替换。以60秒的间隔进行四次测量,以建立PI FOR荧光的静息水平(预刺激)。除去该PI-CTRL溶液并储存在单独的24孔板中。将培养物在27℃下,以各种浓度的谷氨酸孵育60分钟,所有浓度在含有50μg/ ml pi,10μm甘氨酸(Sigma,UK)和No Mg的实验缓冲液中稀释2+。在整个60分钟的孵育期间,以15分钟的间隔进行测量。为了获得PI溶液的背景水平,测量PI-CTRL溶液。然后除去谷氨酸-PI溶液并用PI-CTRL溶液替换。测量以30分钟的间隔拍摄23小时。在24小时结束时,除去PI-CTRL溶液,将EtOH(100%)或Triton X(0.02%)加入到每个孔中以诱导最大死亡。然后加入PI-CTRL溶液,取出5次测量该水平的最大PI FOR度。

成绩与讨论

图1中的信号曲线代表了PI荧光随谷氨酸浓度(0 ~ 200 μM)的变化。随着谷氨酸浓度的增加,所产生的PI信号也显著增加。

为了量化PI信号中的变化,可以使用两种方法:(1)每个单独的PI信号与其相应的静止级别(图3和2)的差异,百分比死亡率与静止级别(0%)和最大死亡由EtOH(100%)或Triton X(0.02%)诱导的(100%)(图4)称为“最小最大范围”。两种方法表明,谷氨酸诱导的死亡是剂量依赖性。此外,使用测量的时间尺寸,可以估计显着的死亡量(发起)的显着量的时间。在这些实验中,谷氨酸酸盐的末端之间的滞后周期与显着的死亡水平的起始依赖于谷氨酸浓度,因此暴露于较大剂量的谷氨酸的培养物具有较短的滞后周期。

结论

我们表明PI测定是监测神经元生存力的非常有用的工具。它允许完全分析对特定物质的响应的动态,这在我们的情况下是神经递质谷氨酸。可以使用该PI方法评估许多参数,包括滞后时间和死亡率。与用于评估神经元生存率的其他方法相比,这是有利的,因为大多数这些方法通常涉及单一终点测量或需要终止制剂。

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