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BMG Labtech微孔板读卡器升高静压压力下细菌生长的高通量监测德赢vwin官网客服

F. Bruce Ward (1) Rosalind J. Allen (2) (1)爱丁堡大学细胞生物学研究所(2)物理与天文学院 03/2009
  • 一种开发适用于高静压压力的微生物生长的微孔板密封技术
  • 深海细菌生长的高通量监测Photobacterium ProfundumSS9
  • 测量的生长速率取决于静水压和渗透压

介绍

微生物在高温、低温、高酸碱度、高盐浓度和高静水压力等极端环境条件下,表现出惊人的生存和增殖能力。在许多情况下,人们对这些能力的生理和生化起源知之甚少。从技术上讲,极端微生物有潜力为分子生物学和其他生物技术领域提供新产品。


我们的工作侧重于深海细菌Photobacterium ProfundumSS9。这种γ-植物间是紧密相对霍乱霍乱P. Profundum.SS9是1984年从苏禄海2.5公里深处分离出来的,是一种亲压生物:它在较高的静水压力下比在大气压力下生长得更好。P. Profundum.SS9可以在0.1MPa至90MPa的压力下生长,最佳生长压力为28MPa。像大多数海洋生物一样,P. Profundum.SS9对NACL有所要求。已经观察到,随着渗透压(增加的盐),静水压力增加的生理效果类似。例如,P. Profundum.SS9响应于盐和静压压力,产生类似的细胞内渗透物系列。我们的作品的目的是了解更好的这种有趣的相似性。

这个学习需要我们成长P. Profundum.SS9在实验室中的静液压和渗透压的一系列条件下。德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器对于这种高通量增长研究非常有价值,因为它们允许快速可靠的测量比使用传统方法较少的劳动力,并且通过使用多重重复来获得更好的统计数据。通过测量600nm的吸光度来监测微生物的生长(a600)随着时间的推移,在板读者中。然而,使用微孔板读者在静水压压力下进行生长提供了不寻常的挑战。使用压力容器实现压力下微生物的生长。本工作中使用的钢制压力容器如图1所示;它充满了加压的液态水。该容器可容纳多达8个标准尺寸的微孔板。这些微孔板必须用薄膜密封,通过强粘合剂附加,以防止压力容器中的泄漏。密封膜必须是柔性的,以允许将压力传递到井含量。井不得含有任何空气,因为井中的气体口袋将压缩在加压上,导致密封伸展和断裂。此外,密封件必须是透明的,以允许吸光度测量,并且必须对研究的微生物无毒。 We have developed a method for sealing microplates that overcomes these challenges. In this application note, we report preliminary results using this method in combination with a BMG LABTECH microplate reader.

材料与方法

细菌菌株和媒体
Photobacterium ProfundumSS9是从Doug Bartlett(Scripces海洋学研究所)教授获得的,并在改进的MOPS最小(MM)培养物中培养。MM媒体是根据Neidhardt等人制作的。最终浓度为40毫米,葡萄糖25毫米,9.5毫米NH4.CL,4 mm三分,1.32 mm k2HPO.4.,0.525 mm mgcl2,0.276 mm k2所以4.,0.05 mm cacl2,0.01 mm feso4.和NaCl浓度范围为100毫米至700毫米。此外,加入痕量元素和维生素溶液,以及0.1%CasaminoAns。


压力耐压96孔板的制备
Greiner Bio-One平板96孔板每孔填充382 μL液体培养基。然后用商业PCR膜密封板,确保气泡没有困在膜下。一旦薄膜就位,在薄膜的边缘涂上一层铝氧树脂并使其固化。这对于防止压力容器内的泄漏是必要的。


高压细菌培养及生长速率计算
在一个3升压力容器中进行高压生长,生长温度为28 MPa,水套温度为15℃。压力是由手泵产生的。测量a600,微孔板被减压,干燥和一个600在BMG Labtech酶标器中测量,无德赢vwin官网客服需去除密封件。测量以3小时的时间进行81小时。


每个实验使用三个相同的96孔微孔板进行。每个平板包含11个重复,7种不同的NaCl浓度。对于每一个NaCl浓度,一个空白井单独容纳介质。最后每板12孔由4个重复的已知A的3种结晶紫溶液组成600范围从0.1到1.5。


使用BMG实验室的火星数据分析软件,将不同时间点的测量结果进行合并。德赢vwin官网客服这些数据随后被导出到Microsoft Excel中。在实验过程中,A600我们的空白井随着时间的变化:这是因为PCR膜随着培养基反应缓慢,并且变得略微不透明。要纠正此效果,我们从每个原始数据点中减去测量的a600对于空白阱(在该NaCl浓度)同时测量。使用含有已知A的晶体紫解的12个孔测试这种消隐方法600;测量一个600随着时间的方式增加时间。从纠正的a600数据,我们能够确定增长率P. Profundum.NaCl浓度范围内的SS9,通过取对数(a600)相对于时间,对于增长曲线的指数部分。

成绩与讨论

实验在28 MPa(最佳生长压力为P. Profundum.SS9)和0.1 MPa(大气压力)。我们还进行了两个对照实验。在第一个对照中,微孔板没有密封,并在大气压力下监测生长,目的是确定密封板中的氧气可用性是否抑制了微孔板的生长P. Profundum.SS9。在第二种控制中,也在大气压下,使用标准聚苯乙烯微孔板盖,通过在厌氧室中胶带盖来防止与孔的气体交换。这应导致与我们的密封微孔板方法(在大气压下)相同的生长速率,因此作为我们的方法的控制。


我们的结果如图2所示。静水压压力对NaCl浓度的范围有明显的影响P. Profundum.SS9能够成长。当静水压压力从0.1MPa增加到28MPa时,生长P. Profundum.SS9在很大程度上不受中间盐浓度(200-400mM NaCl)的影响,但与0.1MPa的结果相比,在较高的NaCl浓度下强烈抑制生长。最佳NaCl浓度仅在改变静水压力时略微改变。有趣的是,在0.1MPa和28MPa下,在200mm以下的NaCl浓度下生长急剧下降。该阈值的位置似乎与静水压压力无关。

有趣的是,在0.1MPa和28MPa下,在200mm以下的NaCl浓度下生长急剧下降。该阈值的位置似乎与静水压压力无关。

这些初步观察表明,这种细菌对水压和渗透压的反应之间存在明显的耦合关系。在0.1 MPa的条件下,我们将开放板和密封板的对照实验结果进行比较,得出的结论是,尽管在NaCl浓度最高的情况下,厌氧板的生长可能会有所下降,但对氧可用性的影响较小。我们还观察到,在0.1 MPa时,胶带盖和密封板的结果之间有很好的一致性,这证实了我们测量生长速率的方法的可靠性。


结论

在本报告中,我们已经证明了BMG Labtech微孔板读者非常适合微生物生长的高通量测定,即德赢vwin官网客服使在静态条件下的极端条件下也是如此。我们已经描述了一种用于96孔微孔板的耐压密封方法的初步测试。

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