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使用荧光各向异性的高通量蛋白-DNA测量

德米特里•b . Veprintsev MRC分子生物学实验室 09/2008
  • 荧光各向异性滴定法用于定量p53-DNA互动
  • 同时进行96个滴定实验
  • 适用范围广泛

表的内容

介绍

肿瘤抑制蛋白p53是一种转录因子,在应对致癌应激和预防肿瘤发展中发挥关键作用。p53突变与50%的人类癌症有关。p53识别一个20 bp的DNA序列,该序列包含两个5 ' -RRRCWWGYYY-3 '的重复序列(其中R= a或G;Y = C或T;W=A或T),间隔0-13 bp。细胞中的基因组DNA通常含有修饰过的核苷酸,如5-甲基胞嘧啶。利用荧光各向异性滴定法,我们研究了修饰的核苷酸对肿瘤抑制因子p53识别DNA的影响(图1)。


测定原理

P53与标记的参考DNA结合,导致高各各向异性值。在添加竞争力DNA后,参考和竞争对手DNA将竞争P53的结合位点。竞争对手DNA将取决于P53的亲和力,并且取决于其浓度导致较低的各向异性值。


荧光各向异性是荧光分子保留激发光偏振并反映溶液中分子的滚转速率的性质。它是研究蛋白质- DNA相互作用的理想材料,因为形成的复合物比未结合的寡核苷酸更大,而且下降得更慢。


在这里,我们描述了一个实验装置,整个滴定实验在一个井中完成。这样的设置显著提高了数据质量,并允许充分利用pherstar®FS来自BMG实验室技术的HTS微孔板阅读器。德赢vwin官网客服

材料与方法

  • 来自康宁的黑色96孔微孔板
  • 来自Eppendorf的Eurogentec epMotion移液机器人的含有修饰碱基(竞争DNA)和alexa488标记的一致寡核苷酸(参考DNA)
  • b组液体处理机器人,速度11
  • PHERAstarFS来自BMG德赢vwin官网客服 Labtech.

使用超稳定的全长p53突变体。在退火前测量寡核苷酸浓度并归一化至1毫米。将寡核苷酸加热至95°C 5 min,冷却至1°C/min至室温,稀释至终浓度50 μM。

在室温(25°C)下通过荧光各向异性进行DNA结合实验。结合实验的缓冲条件为pH 7.2 25 mM磷酸缓冲液、225 mM NaCl、10% v/v甘油和5 mM DTT。总离子强度为286 mM。将牛血清白蛋白(BSA, 0.2 mg/mL)添加到缓冲液中,以减少蛋白质的非特异性结合。标记的参考DNA浓度为20 nM。为了测量参比DNA的结合亲和力(直接滴定法),在1.25 μM的p53原液中也含有20 nM的参比DNA,从而使实验过程中参比DNA的浓度保持恒定。在竞争实验中,20nm报告DNA与全长p53混合,最终浓度为125nm。加入25、50或100 μM的竞争DNA原液,分小股加入,使参比DNA从复合物中分离出来。为了保持参比DNA和p53的浓度不变,竞争对手的DNA储存液中也含有标记的参比DNA和p53。因此,在滴定过程中,只有竞争对手DNA的浓度发生变化。通过在黑色96孔板上进行滴定,使用与pherstar接口的Bravo 96通道移液机器人进行dna结合实验FS带有485/520 nm荧光偏振模块的微孔板阅读器。检测模式设置被优化为焦点位置低于最大信号高度2毫米。滴定时样品体积保持不变(200 μL):在加入等量的结合蛋白(直接滴定)或竞争DNA(竞争实验)前,先抽吸取等体积的样品。每个竞争对手DNA序列在每个板上至少代表3次。每个板都包含参考序列作为对照。

各向异性值按下列公式自动计算:

而我一个是平行发射光和我吗b为垂直发射光。


结果与讨论

回文参考序列CGGACATGTCCGGACATGTCCG由具有代表性的p53共识序列组成,序列两侧是一个C或G核苷酸,在5′末端用Alexa488荧光标记。结果如图2所示。

根据Hill方程(图2,实线)分析结合数据可以确定相互作用的Kd (Kd = p53从DNA序列的解离常数)。


在随后的实验中,我们使用了竞争分析来提高测定参考DNA和竞争DNA结合蛋白亲和力差异的准确性(图3)。分析竞争曲线可以准确测定两个核苷酸的亲和力差异。


竞争分析的结果(图3给出了一个例子)允许确定两个序列之间Kd的差异。这样的滴定对所研究的每一个DNA序列都进行。

特定DNA序列的结合亲和力取决于确切的位置和核苷酸修饰性质(图4)。亲和力的变化可达一个数量级。

图4中的DLogkd示出了相对于未改性参考序列的亲和力差异。参考序列的伐木是-7.55。作为一个例子,在位置4和6处引入修饰的二核苷酸对P53的亲和力具有小的总体影响,并导致最大的修饰特异性反应。


结论

的PHERAstarFS从与液体处德赢vwin官网客服理仪器接口的BMG Labtech,为使用荧光各向异性的高通量测定结合亲和力提供强大的复用平台。Pherastar的敏感性FS在荧光偏振模式中,我们允许我们收集适合于准确测定KD的数据。

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