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Hithunter Camp XS +测定用于使用Pherastar FS进行GPCR筛选

林迪·考夫曼,雪莉琳·德拉莱拉 Discoverx Corporation. 01/2006
  • 直接评估细胞中Gi或Gs偶联的GPCRs
  • 化学发光检测减少了来自荧光化合物的干扰
  • 测定小型化高达1536孔板格式

介绍

G蛋白偶联受体(GPCRs)是一个主要的细胞表面受体家族,介导细胞间通信,GPCRs是“可药物化”靶标的丰富来源。据估计,50%的处方药与GPCRs相互作用。随着用于高通量筛选的功能检测方法的日益普及,对反映GPCR激活并易于小型化的健壮的第二信使检测方法的需求也日益增加。GPCRs在激动剂刺激下调节腺苷酸环化酶活性,进而通过G蛋白Gs或Gi调节细胞环磷酸腺苷(cAMP)水平,形成治疗靶点的子集。cAMP作用于几个下游靶点,包括离子通道、调节基因转录的激酶和细胞代谢。细胞内cAMP水平的变化与GPCR激活相关,因此,cAMP的测定是一种简单的功能测定方法,经常在HTS实验室使用。

Discoverx根据化学发光提供了几种均匀阵营测定,以满足HTS客户的各种需求。


赫希特®cAMP XS+,专门针对提供增强的性能和可用性。在本应用说明中,我们描述了基于在BMG实验室的pherstar上测量的ß-galactosidase(ß-gal)的酶片段互补(EFC)的cAMP测定方法德赢vwin官网客服®FS.多模HTS读卡器。

测定原则

DiscoverX EFC技术基于大肠杆菌的两个片段ß-galactosidase (ß-gal),一个大的蛋白质片段(酶受体,EA)和一个小的肽片段(酶供体,ED)。单独这些片段是不活性的,但在溶液中它们迅速补充(重组)形成活性ß-gal酶,可以水解底物产生发光。在这个实验中,来自细胞裂解液的cAMP和ed标记的cAMP (ED-cAMP)竞争抗体结合位点。EFC的空间位阻发生时,抗体结合的ED-conjugated cAMP,很少或没有活性ß-gal形成。然而,细胞产生的游离cAMP可以竞争性地取代抗体中ed结合的cAMP,并允许ed结合物自由补充EA,从而产生与细胞中存在的cAMP数量成正比的信号(图1)。

材料与方法

德赢vwin官网客服BMG LABTECH的PHERAstarFS.将HTS结合快速的板材读数,以增强读取小型液体体积所需的增强性能和灵敏度。Pherastar.FS.是在发光模式下监视hihunter的吗®CAMP XS +演示套件(DiscoverX Corporation)包含以下试剂:

1) cAMP XS+裂解缓冲液
2)阵营Xs + EA试剂
3)阵营XS + ED试剂
4)阵营Xs +抗体试剂
5)阵营XS +标准(250μm)6a)吡螺恒星®
6B)Emerald-II™

赫希特®cAMP XS+是一套单独的试剂,根据终端用户的需要,可以用于两种不同的方案。

  • 在三种试剂加法中,在PBS或培养基中镀并诱导细胞,并且细胞诱导随后进行三种试剂添加和两个孵育步骤。
  • 在两种试剂添加方案中,细胞被镀和诱导在稀释的抗体溶液中,细胞诱导之后是两种试剂添加和两个孵育步骤。

下表概述了384孔板格式cAMP XS+三种试剂添加方案标准曲线的体积和程序。


表1 cAMP XS+三种试剂加成方案:标准曲线。

384孔板 阵营XS +三种试剂加法协议:标准曲线
步骤1 标准品5 μL PBS稀释
第2步 5μl抗体试剂
第3步 20 μL ED/Lysis/CL工作液
步骤4 室温孵育1小时
第5步 20 μL EA试剂
第6步 室温孵育至少1小时,然后在PHERAstar FS上读取发光信号

根据白色384孔板(Costar)的包装插入协议,运行Discovex CAMP XS +套件的标准曲线,具有60μL总测定体积。在Pherastar上阅读化学发光FS.使用1秒的测量时间加入最后一次试剂后两小时。


成绩与讨论

DiscoverX的HitHunter®cAMP XS+检测以384孔格式制备,标准曲线在BMG LABTECH的pherstar上运行德赢vwin官网客服FS.在发光模式。根据测定方案(二、三种试剂添加方案)加入循环AMP标准检测试剂,并在最后一种试剂添加两小时后进行化学发光检测(图2)50数值用Graphpad Prism软件计算。

结论

GPCRS是HTS药物发现方法中的重要目标,并且可以通过应用Hithunter直接定量营地来检查GPCR信号®阵营XS +套件。在Pherastar上实现了优异的结果FS.多模微孔板读卡器,旨在以所有格式读取所有格式的所有领先的HTS检测模式。高度灵敏度,易于使用的软件,鲁棒硬件和优化的检测系统制作PherastarFS.理想的GPCR分析在高通量检测环境。


Pherastar.FS.在Hithunter的发光模式下运行®采用酶片段互补法(EFC)检测,检测灵敏,假阳性少。对于那些筛选基础cAMP水平较低(细胞裂解液、组织或血清)或cAMP反应水平vwin088较低的困难目标的客户来说,这种方法是一种有用的工具。化学发光信号是强大的,并保证最小的干扰来自文库化合物。稳定的信号在读取时间上具有灵活性,即可以在同一天或经过一夜的孵育后读取检测结果。


虽然目前有几个CAMP测定,但大多数都不能扩展到用于为大型化学文库的自动化高通量筛选的1,536孔格式的小型化。Discoverx根据不同的应用,读数,样本和单元格类型提供此测定的几种不同配置。有关Discoverx Assays的更多信息,请参阅网站:www.discoverx.com.


hithhunter, DiscoverX和DiscoverX标志是DiscoverX公司的注册商标。

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