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hithhunter IP3法用于GPCR筛选,使用PHERAstar FS

林迪·考夫曼,雪莉琳·德拉莱拉 DiscoverX公司 05/2006
  • PHERAstar®FS.采用多模式高通量微孔板读卡器访问Gq耦合的GPCRs
  • 赫希特®是否有一种鲁棒且敏感的均相荧光偏振测试仪可以测量IP3水平
  • 测定小型化高达1536孔板格式

表的内容

介绍

G蛋白偶联受体(GPCR)的激活通过几个第二信使调节细胞信号,包括3’-5’环AMP (cAMP)、肌醇磷脂和钙。这些第二信使的积累定量被用于GPCR配体的药理特征和在高通量筛选(HTS)中鉴定新化合物。GPCRs偶联GαS.和gα.一世蛋白质分别激活或抑制腺苷酸环化酶,随后改变细胞内cAMP水平。GPCRs偶联Gα问:或GαO.蛋白质激活磷酸肌醇磷脂酶C-ß,一种水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP)的酶2) 来形成sn1,2-二酰基甘油和肌醇- 1,4,5-三磷酸(IP3)。IP3结合并打开内质IP3门控的钙通道,导致结合的钙释放到细胞质中。IP3的代谢产物也调节细胞信号,如肌醇1,3,4,5-四肽磷酸(Ins P4),它协同促进IP3,介导钙的释放。DiscoverX开发了一种基于荧光偏振(FP)的均匀检测方法,用于测量GPCR激活产生的IP3水平。这个应用笔记,描述了IP3分析和PHERAstar的使用FS.多模高温超导平板阅读器。


该检测基于FP模式,使用一种专有的结合蛋白,对IP3的活性异构体具有高度选择性。该试验是竞争性结合试验(图1),其中细胞IP3取代IP3的荧光衍生物从一个特定的结合蛋白。该测定法是一种单波长比率测定技术,用IP3的荧光衍生物作为示踪剂来测定FP的变化。在未标记IP3的实验中,标准IP3溶液或来自细胞裂解液,取代结合蛋白的示踪剂,旋转时间增加,低FP信号被测量。通过这种方法,对标准IP3稀释度进行校准,并通过插值法确定细胞裂解液中IP3的摩尔浓度。

材料与方法

德赢vwin官网客服BMG LABTECH的PHERAstarFS.结合高温超导所需的快速极板读数与读取小流体体积所需的增强性能和灵敏度。该多模孔板阅读器具有在最苛刻的分析中表现出色的灵活性,并设计为读取所有领先的高温超导检测模式(荧光强度,时间分辨荧光,荧光偏振,发光和吸光度)的所有格式,最高可达1536。的PHERAstarFS.在FP模式下是用来监视hihunter的吗®IP3演示套件(Discoverx Corp.)包含以下试剂:

hithhunter IP3试剂盒试剂
1 IP3标准- 20 μM
2 IP3标准稀释缓冲液
3. 高氯酸(PCA) - 0.2 N
4. IP3跟踪器 - 绿色
5. IP3结合蛋白

根据包插入方案,在黑色384孔板(无结合聚丙烯板;在加入最后一种试剂一小时后,按照如下的平板阅读器设置方案在PHERAstar FS上读取荧光偏振信号(图2)。

下表概述了IP3方案在384孔板中测量标准曲线和激动剂/拮抗剂处理的细胞的体积和程序。测定激动剂/拮抗剂处理的细胞,IP3水平稳定加入5 μL 0.2 N高氯酸。

表1:HitHunter®标准曲线和激动剂/拮抗剂处理的细胞的IP3方案。

HitHunter IP3协议
健康)状况 标准曲线 细胞受体激动剂 细胞拮抗剂
步骤1:标准/单元格 10μl标准 10μL细胞 10μL细胞
步骤2:拮抗剂 - - 5μL拮抗剂
孵化 - - 30分钟。在37°C
步骤3:受体激动剂 5μL水 5μL受体激动剂 5μL受体激动剂
孵化 - 20秒(室温)
步骤4:主成分分析 5 μL PCA -0.2N
第五步:示踪剂 10 μL IP3示踪绿色
第六步:结合蛋白 20 μL IP3结合蛋白
轻轻搭接平板甚至混合(摇架5分钟)
在Pherastar上读取荧光极化信号FS.
(激励滤波器485nm /发射滤光器520nm)

结果与讨论

DiscoverX Hithunter®IP3以384口井的格式制备,标准曲线在BMG LABTECH的pherstar上运行德赢vwin官网客服FS.在荧光偏振模式下。按照测定方案加入IP3标准试剂,在最后一种试剂加入1小时后读取荧光偏振信号。的Hithunter®IP3标准曲线在下面的FI Gure中示出(FI Gure 3)。

的Hithunter®IP3检测是一种强大的,敏感的和特定的工具,用于测量细胞d -肌醇1,4,5-三磷酸。该信号是基于IP3荧光示踪剂与细胞裂解液或IP3标准物中未标记的IP3之间的竞争性结合。该信号被解读为荧光偏振的变化,与细胞裂解液中IP3的含量成反比。与背景的标准曲线信号为>5,EC50是13纳米。信号可以立即或高达16小时后测量。


结论

GPCRs是HTS药物发现的关键靶点,应用hithhunter可以直接定量IP3检测GPCR信号®IP3套件。在Pherastar上获得了良好的结果FS.多模微孔板读卡器,旨在以高达1536的格式读取所有领先的HTS检测模式。高度灵敏度,易于使用的软件,强大的硬件和优化的检测系统,使Pherastar更高FS.理想的GPCR分析在高通量检测环境。

“pherstar”是在FP模式下运行的®IP3检测,使用FP检测灵敏度高,使用方便。该试验是理想的检测基础水平的IP3细胞裂解液,以及低水平的IP3诱导。一旦细胞被溶解,可以在同一天或一夜读取稳定的检测信号。目前很少有健壮的IP3检测方法可用,而且没有一个易于扩展到1536自动化。DiscoverX提供的这种检测方法为GPCR筛选提供了最大的精度和可靠性。


有关DiscoverX化验的更多信息,请参阅网站:www.discoverx.com


hithhunter, DiscoverX和DiscoverX标志是DiscoverX公司的注册商标。

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