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Hithunter IP3使用Pherastar FS进行GPCR筛选

Lindy Kauffman Sherrylyn de la Llera Discoverx Corporation. 05/2006
  • Pherastar.®FS.多模高吞吐量微孔板读卡器用于访问GQ耦合GPCR
  • 赫希特®是一种稳健且敏感的均匀流动晶体偏振测定,以测量IP3水平
  • 测定小型化高达1536孔板格式

介绍

G蛋白偶联受体(GPCR)活化通过几个第二信使调节细胞信号传导,包括3'-5'-CAMP),肌醇磷脂和钙。这些第二信使的积累的​​定量用于药理学表征GPCR配体的作用和鉴定高通量筛选(HTS)中的新化合物。GPCR耦合到GαS.和gα.一世蛋白质分别激活或抑制腺苷酸环化酶,随后改变细胞内cAMP水平。GPCR耦合到Gα问:或gα.O.蛋白质激活磷酸肌醇磷脂酶C-β,一种水解磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸盐(PIP的酶)2) 来形成-1,2-二酰基甘油和肌醇-1,4,5-三磷酸(IP3)。IP3结合并打开内质值IP3门控钙通道,导致结合钙释放到细胞溶胶中。IP3的代谢产物也调节细胞信号传导,例如肌醇1,3,4,5-四磷酸酯(INS P4),其协同促进IP3,介导的钙释放。Discoverx已经开发了基于FLOORESPEAT极化(FP)的均匀测定,以测量GPCR活化产生的IP3水平。本申请说明,描述了IP3测定以及Pherastar的使用FS.多模HTS读卡器。


测定基于使用专有的结合蛋白基于FP模式,该蛋白质是IP3的活性异构体的高度选择性。测定是竞争性结合测定(FI Gure1),其中细胞IP3从标本结合蛋白中取代IP3的流荧光衍生物。测定法测量FP的变化,单个波长比例技术,其中IP3的FL荧光衍生物用作示踪剂。在测定未标记的IP3中,标准IP3溶液或衍生自细胞裂解物,从结合蛋白移位示踪剂,并测量旋转时间增加并且测量低FP信号。通过这种方式,在标准IP3稀释液中产生校准,并且通过插值确定细胞裂解物中IP3的摩尔浓度。

材料与方法

德赢vwin官网客服BMG Labtech的PherastarFS.将HTS所需的快速板读数与读取小流量卷所需的增强性能和灵敏度相结合。多模微孔板读取器具有最苛刻的测定的excel的灵活性,并且旨在以所有格式读取所有格式的所有领先的HTS检测模式(流浊强度,时间分辨率,发光,发光,发光,发光,发光,发光,发光,发光,发光,发光,发光,发光,发光,发光,发光,发光,发光和吸光度)。该Pherastar.FS.以FP模式运行以进行监控Hithunter®IP3演示套件(Discoverx Corp.)包含以下试剂:

Hithunter IP3套件试剂
1 IP3标准 - 20μm
2 IP3标准稀释缓冲液
3. 高氯酸(PCA) - 0.2 n
4. IP3跟踪器 - 绿色
5. IP3结合蛋白

The standard curve for DiscoverX’s IP3 kit was run according to the package insert protocol in black 384-well plates (non-binding polypropylene plates; Greiner), and the fluorescence polarization signal was read on the PHERAstar FS one hour after the addition of the last reagent using the following protocol for plate reader setup (figure 2).

下表概述了IP3协议的卷和程序,以384孔板格式测量标准曲线和激动剂/拮抗剂处理的细胞。测量激动剂/拮抗剂处理的细胞,通过加入5μl0.2N高氯酸稳定IP3水平。

表1:Hithunter®标准曲线和激动剂/拮抗剂处理细胞的IP3方案。

Hithunter IP3协议
状况 标准曲线 细胞激动剂 细胞拮抗剂
第1步:标准/细胞 10μl标准 10μL细胞 10μL细胞
第2步:拮抗剂 - - 5μl拮抗剂
孵化 - - 30分钟。在37°C
第3步:激动剂 5μl水 5μl激动剂 5μl激动剂
孵化 - 20秒(室温)
第4步:PCA 5μlpca -0.2n
第5步:示踪剂 10μlip3纹理绿色
第6步:结合蛋白 20μLIP3结合蛋白
轻轻搭接平板甚至混合(摇架5分钟)
在Pherastar上读取荧光极化信号FS.
(激励滤波器485nm /发射滤光器520nm)

成绩与讨论

Discoverx Hithunter.®IP3以384孔的格式准备,并在BMG Labtech的Pherastar上运行标准曲线德赢vwin官网客服FS.在流荧光偏振模式下。根据测定方案加入IP3标准试剂,并在添加最后一次试剂后1小时读取FOR晶体偏振信号。赫希特®IP3标准曲线在下面的FI Gure中示出(FI Gure 3)。

赫希特®IP3测定是一种用于测量细胞D-Myo-inositol1,4,5-三磷酸的鲁棒,灵敏和特定的工具。该信号基于IP3流荧光示踪剂与来自细胞裂解物或IP3标准的未标记IP3之间的竞争结合。将信号作为流动晶体变化的变化读取,并且与细胞裂解物中的IP3的量成反比。标准曲线信号到背景为> 5,EC50.是13纳米。信号可以立即或高达16小时后测量。


结论

GPCRS是HTS药物发现中的关键目标,通过应用Hithunter,可以通过直接定量IP3来检查GPCR信令®IP3套件。在Pherastar上获得了良好的结果FS.多模微孔板读卡器,旨在以高达1536的格式读取所有领先的HTS检测模式。高度灵敏度,易于使用的软件,强大的硬件和优化的检测系统,使Pherastar更高FS.高通量测定环境中GPCR分析的理想选择。

Pherastar在Hithunter中以FP模式运行®IP3测定,使用FP进行Sensitivite检测和易用性。测定是检测细胞裂解物中的基础IP3的基础水平,以及IP3诱导的低水平。一旦细胞裂解,稳定的测定信号可以在同一天或过夜读取。目前有很多强大的IP3测定仪器,无容易可扩展到1536自动化。Discoverx提供该试验,以提供GPCR筛选的最大精度和可靠性。


有关Discoverx Assays的更多信息,请参阅本网站:www.discoverx.com.


Hithunter,Discoverx和Discoverx Logo是Discoverx Corporation的注册商标。

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