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在BMG Labtech Pherastar FS上进行均质IgG alphalisa测德赢vwin官网客服定

法兰卡甘糕(1)Keith Ansell(2) (1)B德赢vwin官网客服MG LABTECH(2)MRC-T 03/2009
  • IgG alphalisa.®在BMG Labtech的Pheras德赢vwin官网客服tar进行测定®FS.
  • Z'Value为0.92表示高稳健的测定与高质量仪器相结合
  • IgG检测极限确定为<0.21 ng / ml

介绍

免疫球蛋白或抗体是参与免疫应答的蛋白质。它们在外源物质(抗原)高亲和力。免疫球蛋白(Ig)根据结构进行分类。血浆中最多存在的抗体是IgG。它是次级抗体反应的一部分,并在抗原识别后3周建造。有几种测定用于测定IgG可商购的IgG。本应用笔记显示使用Alphalisa检测IgG®在BMG Labtech的Pheras德赢vwin官网客服tar进行测定FS.


测定原则

alphalisa.®来自PerkinElmer的技术基于alphascreen®检测方法:在680nm的激光激发时,在供体珠子珠粒中,环境氧被转化为单次氧的氧,每秒高达60,000分子。单线次氧分子的寿命短(在水溶液中4μs),漫射不超过200nm。当生物分子相互作用使供体和受体珠子接近时,单向氧达到受体珠,并开始产生大大扩增的发光信号的化学反应。IgG alphalisa的测定原理®测定在图1中给出。

抗IgG抗体涂覆的受体珠和生物素化的抗IgG抗体与IgG结合。在第二步中,加入链霉蛋白涂覆的供体珠并结合生物化抗IgG抗体。当IgG存在于样品中时,供体和受体珠粒紧密近。在680nm处激光激发后,开始化学反应级联,导致615nm的发光信号。如果没有IgG存在,则不会检测到发光。

材料与方法

  • alphalisa.®IgG套件,PerkinElmer
  • 白色不透明384-Well Optiplate™,PerkinElmer
  • 白色384-井小音量板,Greiner
  • Pherastar.FS.微孔板读者,BMG Labtech德赢vwin官网客服

IgG alphalisa.®标准曲线是根据套件协议进行的。简而言之,在alphalisa中制备冻干IgG的连续稀释®免疫测定缓冲液。将受体珠和生物素化抗体的混合物加入到12个标准的每一个中并达到坯料(含有NO IgG)。室温下60分钟孵育后,加入供体珠。随着供体珠子的光敏感,必须在较低的或绿光下进行该步骤。在黑暗中孵育30分钟后的alphalisa®信号在Pherastar中测量FS.。德赢vwin官网客服BMG Labtech开发了一个字母®具体的光学模块和384孔板的仪器设置可以在下面找到。

仪器设置

测量方法: alphascreen.®
阅读模式: 终点
光学模块: alphalisa.®680 615.

常规设置

定位延迟: 0.10秒
激发时间: 0.30秒
集成开始: 0.34秒
集成时间: 0.30秒
获得: 3600.

在小瓶中制备850μL每种标准和坯料。孵育后,将一定量的反应混合物转移到两种不同类型的384孔微孔板中。用于384孔标准板50μL,17μL是384孔小体积板中的最终体积。每个板由12个重复组成,用于含有不同IgG浓度和坯料的标准。由于填充高度不同,建议为每种板式进行一次焦点调整。焦距将优化,导致最高的敏感性。


成绩与讨论

图2显示了使用50μL体积的384孔板中获得的IgG标准曲线。

对于低浓度,优选线性线性刻度(图3)。使用MARS数据分析软件,可以轻松绘制两个标准曲线。

Z'值,评估HTS方法的标准,并针对两个板类型计算IGG检测的限制(表1)。下面给出两个计算的公式。

其中μ.P.=“阳性控制”(max比率),μ的平均值N=“阴性控制”(min比率)的平均值,S =相应的标准偏差。


通过在标准曲线上插入平均空白值+ 3x的平均空白值+ 3x来确定检测限(LOD)(4-参数拟合)。

表1:Z'值和IgG含量为50μl,17μl。

板式格式 384孔标准板50μL 384 - 井小体积板17μL
Z'Value. 0.92 0.91
IgG检测限制(Ng / ml) 0.21 0.27

结论

IgG alphalisa.®检测试剂盒在Pherastar上成功进行FS.。在384孔标准板中达到了试剂盒制造商所示的灵敏度,略高于384孔井小体积格式。尽管如此,我们可以表明,可以将测定体积降至17μL,具有良好的灵敏度和非常好的Z'值。多职HTS Reader PherastarFS.在alphascreen中显示出良好的表现®和alphalisa.®模式为384 - 小卷板格式。易于使用的软件允许简单的测定优化有关灵敏度和读取时间。Pherastar.FS.设计用于阅读所有HTS检测模式(荧光强度,时间分辨荧光,荧光极化,发光,alphascreen®和吸光度),所有板格式高达1536孔。

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