在PHERAstar FS酶标仪上进行HTRF IP-One检测

介绍

HTRF.^®由CISBIO INTERIONATIONAL制定的（均匀时间分辨流荧光）技术用于分析开发和药物筛查。HTRF.^®是基于欧盟之间的焦躁³⁺cryptate(供体)和第二个荧光标记(受体)。一种新的受体d2，允许引入一个完整的GPCR (G蛋白偶联受体)平台，适合于药物发现。激活后，GPCRs通过两条主要信号通路在细胞内携带信息:Gαs或Gαi偶联GPCRs的激活导致cAMP水平的变化，而Gq偶联GPCRs的激活导致细胞内Ca的短暂增加²⁺由肌醇（1,4,5）三磷酸酯（IP3）触发。因此，循环AMP和IP3代表了两个基本的二级信使，用于监测大多数GPCR的活动。

在Gq通路中，信号级联的前体分子IP3是一种非常不稳定的产物(转换仅需几十秒)，其降解是不可逆的。IP3诱导细胞内短暂的钙释放。钙感应，通过一个非常远程的指示器，可以高通量调查GPCR活性。鉴于其极具挑战性的实施，迄今为止，在高温超导中还没有广泛使用IP检测方法。由于缺乏更好的选择，参考方法包括检测放射性前体吸收和亲和分离后级联不同肌醇磷酸盐(IP3, IP4, IP2和IP1)的积累。

最近Cisbio推出了一个主要的新套件，HTRF^®在HTS条件下，IP-ONE，用于GQ路径调查。IP-One套件允许粉末1磷酸盐（IP1）的蜂窝聚合物堆积的量化。

本应用说明着重于IP1分析，该分析已在使用多模平板阅读器pherstar的Gq耦合受体的广泛和代表性选择上得到验证FS.来自BMG德赢vwin官网客服 Labtech。这个htrf.^®认证兼容阅读器能够同时检测两个波长(620 nm和665 nm)的荧光，进一步的信号配比也使该技术能够克服来自介质或化合物的干扰。

测定原理

在级联反应的最后阶段，当IP1转化为肌醇时，可以使用LiCl进行阻断，这可以使Gq通路的一个基本子产物得到稳定(图1)，正如IBMX作用阻止cAMP降解一样。在它的最终构型中，它引入了一个高度特异性的单抗，偶联到europium cryptate和IP1偶联到新的HTRF^®受体，D2。这种微小的专有分子，具有与XL665的光学特性类似（参考HTRF^®接受者），显着提高了技术的表现，特别是在IC方面_50.稳定性和测量动力学。

材料与方法

CISBIO的均匀IP-ONE测定可以在单个微孔板中进行，在运行实际测试前一天已经分配了细胞。细胞刺激条件满足所用细胞系的特定特征 - 通常在37℃下通常30分钟。将两种稀释的缀合物分配到裂解溶液中后获得累积IP1的量化。

在仅在一次孵化之后可以进行测量，并且在不受影响的情况下根据需要重复多次（例如IC50）。套件的标准曲线根据白色384孔板（Costar Cat＃3711384）中的包装插入协议进行，具有20μL总测定体积。HTRF.^®信号在Pherastar上读取FS.。

由Institut de Genomique fonctionlle（IGF），蒙彼利尔，法国和EuroScreen，比利时友好提供细胞。

表达感兴趣的GPCR靶标的细胞系（参见表1）用于通过刺激配体测量IP1产生。以384孔的形式，将细胞悬浮液分配在15,000个细胞/20μL/孔中。在37℃温育后，完全丢弃培养上清液。然后加入含有各种浓度配体的10μL刺激缓冲液。在37℃温育1小时后，加入5μLIP1-D2缀合物，然后加入5μL标记的抗IP1抗体。在4℃温育后，用Pherastar FS测量620nm和665nm处的时间分辨率荧光，并计算信号和δf的比率。

Delta F％=（标准或样品比率 - Rationeg）/ Rationeg x 100

结果与讨论

如表1所示，即使所涉及的细胞系未针对IP-ONE测定，也已经在不同的模型和目标上验证了IP-ON。

表1：已经用IP-One测定验证的GPCR列表，用于激动主义反应。细胞中的GPCR表达是稳定的，瞬时（t）或内源（e）。HTRF.^®在BMG Labtech的板式读卡器上进行了iPone测定。德赢vwin官网客服

GPCR目标	细胞系	激动作用者	FC.50.HTRF.®IP-one	FC.50.同位素方法
穆斯卡林 M1 /《Gq》(s)	CHO-K1	乙酰胆碱 氯化氨甲酰胆碱	71海里 296 nm.	42 nm. 300 nm.
后叶加压素 V1A / GQ（S）	CHO-K1	后叶加压素 后叶加压素	1海里 1.6纳米	0.4 nm. 0.4 nm.
催产素 OT /《Gq》(s)	CHO-K1	催产素	13 nm.	7纳米
组蛋白 H2 / G16（s）	CHO-K1	Amthamine	21 nm.	16纳米
嘌呤能 p2y1 / gq（s）	1321 n1	2-甲基ADP	6.8纳米	N.D.
胆囊囊炎 CCK1 / GQ（S）	1321 n1	CCK8硫酸盐	2nm.	43 nm.
Chemokine CCR5 / G16	CHO-K1	咆哮 MIP1α	76 nm. 48 nm.	26 nm. N.D.
Hupcar / GQ（S）	CCL39.	钙	2.9 nm.	N.D.
内皮素 ETB / GQ（s）	CHO-K1	内皮素2. Ala-indothelin.	82海里 70海里	83海里 93海里
TRH1 / GQ（S）	CHO-K1	TRH.	0.8 nm.	N.D.
GB1 + GB2 / GQI9（T）	HEK293	加布	980海里	484 nm.
mglur 1 / gq（t）	HEK293	Quisqualate.	113 nm.	75 nm.
mglur 5 / gq（t）	HEK293	Quisqualate.	13 nm.	9纳米
穆斯卡林 立方米/《Gq》(e)	HEK293	乙酰胆碱	20μM	N.D.
purynergic. p2y1 / gq（e）	HEK293	UTP. atp.	2.1μm 1.6μm	N.D. N.D.

验证还得出使用GA16或GQI9型嵌合结构在细胞系存在下证明测定的性能。

IP-One测定在不同的细胞背景，稳定或瞬时转染细胞和嵌合构建体上表现出同样良好的性能。可以观察到与参考方法具有很强的相关性，并且可以观察到具有50μm的以下（磷酸）磷酸盐的交叉反应性：Myo-inositol，Pip2，Pip3，IP2，IP3和IP4。

此外，在1321N1-CCK1细胞系和激动剂cck8 -硫酸酯上应用IP-One检测。实验是在96孔板上进行的，因此EC非常接近_50.关于％抑制/基础曲线（FI Gure 2）的值和非常好的相关性。z'计算时的激动剂浓度等于EC₈₀结果Z ' >为0.78。