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HTRF IP-One用于功能筛选

海莉·琼斯(1)弗兰卡·甘斯克(2) (1) MRC Technology (2) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH 12/2014
  • 用新鲜细胞和冷冻细胞筛选单细胞克隆功能
  • 功能HTS为MRCT 100K化合物收集
  • 利用HTRF光模块简化了筛分检测

表的内容

介绍

G蛋白偶联受体(GPCR)是最显著的治疗靶点。在大多数情况下,GPCRs的激活要么导致细胞cAMP水平的改变,要么导致细胞内钙离子的释放。可以通过直接或间接定量这些第二信使来测定受体激活的各种分析方法。


Cisbio Bioassays开发了高度精确的HTRF®测定第二信使,如HTS格式的IP1或cAMP。这个应用程序说明演示了IP-One HTRF的使用®从稳定转染的重组CHO-M1细胞中筛选功能性克隆的试验。紧接着,给出了高通量筛选甘丙肽受体GALR2的结果。该筛选使用了MRCT 100K化合物集合,这是一种从商业文库中选择的药物样分子,其中包括10000多种靶向蛋白-蛋白相互作用的化合物。


测定原理

一个健壮的HTRF®采用功能性IP1法(Cisbio)进行筛选。该测定法是基于一种竞争性免疫测定原则,即自由IP1与IP1-d2竞争(HTRF®受体)与反ip1密码共轭物(HTRF®捐赠)。在没有IP1的情况下,信号与产生最大FRET的细胞中的IP1水平成反比(图1)。

材料与方法

  • CHO细胞稳定表达GalR2 (GE Healthcare)
  • 新鲜和冷冻CHO-M1细胞系,CCS培养服务,德国
  • IP-One HTRF®试验设备(Cisbio)
  • 白色384孔小卷板(Greiner)

单细胞克隆筛选
用编码gaq偶联的人毒菌碱乙酰胆碱受体M1 (CHRM1)的表达载体转染CHO-K1细胞。在384孔板上用G418筛选稳定转染的单克隆细胞系。为了筛选具有功能性激动剂反应的克隆,将10,000个细胞接种到384孔的白色板中,并留置过夜。第二天,培养基被丢弃,每个克隆的细胞被激动剂刺激1小时,而相同的细胞在对照井不处理。按照标准的冷冻方案制备细胞,用于实验如下:解冻后,细胞在培养液中洗一次,再悬于IP1刺激缓冲液中。为了弥补新鲜细胞生长过夜的预培养时间,冷冻细胞以2倍密度每孔20000个细胞的密度播种。接种后立即将激动剂加入悬浮细胞中。

GalR2筛选
使用稳定表达GalR2的CHO细胞配置试验。用亚最大浓度的甘丙肽激动剂预孵育细胞,使高温干细胞对同时检测激动剂和PAMs敏感。MRCT 100K化合物收集以最终检测浓度为10µM筛选。5µl cells/well (15,000 cells),加入2.5µl compound或buffer control到384个低体积的白板上。37℃孵育30分钟后,以最大浓度1µM (EC100)或最低浓度3.16 nM (EC20)加入2.5 ml甘丙肽。测试样品收到含有0.1% BSA的缓冲液。平板在37°C孵育1小时。


HTRF®ip - 1检测PHERAstar®FS
的IP-One HTRF®实验按照Cisbio推荐的方法进行。简单地说,供体和受体连续加入细胞,在室温下孵育1小时。然后把盘子放进pherstarFS标仪。使用HTRF专用光模块同时测量665 nm和620 nm信号。

数据计算
通过计算在620和665 nm处获得的原始数据的比例来进行数据归一化:


比率= (665/620)* 10000


结果与讨论

单细胞克隆筛选
在生理配体乙酰胆碱(1µM)刺激下,通过IP-One HTRF对重组CHO-M1克隆进行功能筛选®化验。(图2)。

在134个克隆中有27个对激动剂表现出显著的反应,但反应的敏感性不同。选择一株细胞系(克隆B2),用部分激动剂卡巴可(carbachol)做剂量响应曲线(图3)。

HTS检测结果良好,符合Z’数据。筛选出85320个化合物,平均Z′为0.72(±0.05)。点击次数如表1所示。

截止(%) #支安打
30. 250
40 117
50 65
60 29
70 13
80 9
90 4
One hundred. 1

屏幕给出了一个相当低的点击率(30%活动时为0.3%)。


结论

的IP-One HTRF®Cisbio的检测被证明是一种快速、可靠的方法,可以直接使用PHERAstar筛选大量样品FS标仪。一个强大的检测可以建立使用新鲜细胞从一个生长培养以及冷冻即时细胞。

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