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用于功能筛选的HTRF IP-ONE测定

Hayley Jones(1)法兰卡甘糕(2) (1)MRC技术(2)BMG LABTECH德赢vwin官网客服 12/2014
  • 单细胞克隆使用新鲜和冷冻细胞功能筛选
  • MRCT 100K复合集合的功能性HTS
  • 使用HTRF光学模块简化了筛选检测

介绍

G蛋白偶联受体(GPCR)是一种最突出的治疗目标。在大多数情况下,GPCR的激活导致细胞阵营水平或从细胞内储存的钙离子的释放中。可以通过直接或间接量化这些第二信使来确定各种测定以确定受体激活。


Cisbio Bioassays开发了高度准确的HTRF®以HTS格式测量IP1或CAMP等第二信使的测定。此应用笔记演示了IP-One HTRF的使用®测定来自稳定转染的重组CHO-M1细胞的克隆功能选择。在此旁边,提出了一种高通量筛选Galanin受体Galr2的结果。该筛网采用MRCT 100K复合收集,来自商业文库的一种类药物的药物类别,其包括超过10,000种靶蛋白质相互作用的化合物。


测定原则

强大的HTRF.®功能性IP1测定(CISBIO)用于筛选。该测定基于竞争激烈的免疫分析原理,即免费IP1竞争IP1-D2(HTRF®接受者)用于绑定到抗IP1加密共轭(HTRF®捐赠者)。信号与在不存在IP1的情况下获得的电池中的电池中的IP1水平成反比(图1)。

材料与方法

  • CHO细胞稳定表达GALR2(GE Healthcare)
  • 新鲜和冷冻CHO-M1细胞系,CCS文化服务,德国
  • IP-One HTRF®测定套件(Cisbio)
  • 白色384-井小容量板(Greiner)

单细胞克隆筛选
用编码GaQ偶联的人毒蕈碱乙酰胆碱受体M1(CHRM1)的表达载体转染CHO-K1细胞。通过在384孔板中选择稳定转染的单克隆细胞系分离出G418。为了筛选用于功能性激动剂反应的克隆,将10,000个细胞接种到白色384孔板中,并留下过夜。第二天将培养基丢弃,并用激动剂刺激来自每种克隆的细胞1小时,同时对照孔中的相同细胞保持未处理。根据标准冷冻方案制备细胞,如下使用,如下:解冻后,在培养基中洗涤一次细胞并重新悬浮在IP1刺激缓冲液中。为了弥补夜间生长的新鲜细胞的预孵育时间,将冷冻细胞以每孔20,000个细胞的双密度接种。在播种后立即将激动剂加入到悬浮液中的细胞中。

GALR2筛选
使用稳定表达GALR2的CHO细胞来控制测定。具有亚比兰激动剂的亚大浓度的细胞预孵育,使HTS同时检测两个激动剂和PAM。MRCT 100K复合物收集以10μm的Fi NAL测定浓度筛选。分配5μL细胞/孔(15,000个细胞),将2.5μl化合物或缓冲液对照加入384孔低容积白板中。在37℃下30分钟温育后,以1μm(EC100)的最大浓度或高度最小的3.16nm(EC20)的最大浓度加入2.5ml环蛋白。测试样品接受含有0.1%BSA的缓冲液。将平板在37℃下孵育1小时。


HTRF.®Pherastar上的IP-ONE测定®FS.
IP-One HTRF®按照CISBIO的推荐进行测定。将Brie Fl y,供体和受体连续加入细胞,然后在室温下孵育1小时。然后将板放入pherastar中FS.微孔板读者。通过使用HTRF特定光学模块同时测量665和620nm信号。

数据计算
通过计算在620和665nm处获得的原始数据的比率来执行数据归一化:


比率=(665/620)* 10000


成绩与讨论

单细胞克隆筛选
在用生理配体乙酰胆碱(1μm)刺激后,通过IP-One HTRF在功能上筛选重组CHO-M1克隆®测定。(图2)。

在134个克隆27中表现出对具有不同敏感性的激动剂的角度。将一种选定的细胞系(克隆B2)用含有卡巴酰基,部分激动剂(图3)进行剂量响应曲线。

HTS测定良好地表现得很好,如强大的Z'数据所示。对于85320筛选的化合物,得到0.72(±0.05)的平均Z'。表1中的命中数量呈现。

隔断 (%) #hits.
30. 250.
40 117.
50. 65.
60. 29.
70 13.
80 9.
90. 4.
100. 1

筛网的击中率相当低(30%活性为0.3%)。


结论

IP-One HTRF®从CISBIO的测定被证明是一种快速可靠的方法,可以使用Pherastar直接筛选大量样品FS.微孔板读者。可以使用来自生长培养物的新鲜细胞以及冷冻的即时细胞来建立鲁棒的测定。

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