HTRF(均匀时间分辨荧光)

什么是htrf?

均匀时间分辨荧光(HTRF®)是由CISBIO开发的时间分辨的FRET(TR-FRET)免疫测定。这项技术结合了时间分辨荧光(TRF)用荧光共振能量转移(FRET)检测,主要用于高通量的药物筛选。


荧光共振能量传递是一种接近测定,当它们处于近距离接近时,利用在两种荧光团(称为供体和受体)之间发生的能量转移。在通过光源激励供体时,如果两个之间的距离在20到90之间,则能量从供体转移到受体。激发的受体在给定波长下发射荧光。


FRET主要用于分析分子结合事件或相互作用。通过将每个结合配偶体与荧光团进行偶联,并通过检测所发生的能量转移水平来评估这些。


GFP / RFP和CFP / YFP稳态荧光尺寸对已广泛用于荧光强度测定。然而,可以用标准尺寸难以获得高敏感的测量。该方法受到散射激发光和自发荧光的背景噪声的负面影响。


HTRF原则

通过采用时间分辨荧光,TR-FRET.通过在激励和检测之间引入时间延迟,允许消除短寿命稳态背景荧光。通过使用称为镧系元素作为供体的长寿命的荧光团来实现这一点。
事实上,时间分辨的褶皱和HTRF测定依赖于镧系材供体和短寿光荧光团受体之间的能量转移,当时近距离。由于大的斯托克斯偏移,与荧光素或罗丹明等稳态荧光团相比,镧系为这些应用非常适合这些应用。


由于这些特定的特性,时间分辨的褶皱和HTRF表现出改善的稳定性和特异性的性能水平。缓冲或培养基干扰由长寿命的荧光显着减少,并且通过对供体和受体的两个发射波长的比率检测显着降低。


应用均相定期荧光技术如何应用​​的一般原理在不同的应用中非常相似。针对两种靶标(或标签)中的每一个的特异性抗体,与供体或受体标记的待研究的相互作用。如果目标紧邻,则抗体也将是。通过激动施主,能量将转移到受体,这是由于荧光共振能量转移发射。最终信号与发生的结合量成比例。或者,供体和受体可以与相互作用的合作伙伴共价结合。

HTRF技术

在HTRF中使用四种特定的荧光团,形成不同的时间分辨的褶皱耦合。供体镧系元素荧光团是铕(EU3 +)或铽(TB2 +)粘合剂(图1),而稳态荧光受体通常在红色范围内发射。


HTRF捐助者

随着铕和铽离子唯一的荧光灯,它们需要嵌入光收集笼中以发光。HTRF技术为此目的使用了加密。类似于其他TRF和时间解决的烦恼技术的螯合物,加密允许收集和转移能量。然后,受体荧光团作为特定波长的光释放这种能量。


镧系镧密码络合物不像几种常规荧光团一样受到光漂白的约束,并且据说在各种化学条件下非常稳定。


铽密码具有10至20倍的量子产量增加和与铕相比更高的摩尔消光系数,提高筛选性能的特点。[1]可以在同一HTRF板读数器上读取铕和基于铽的测定。

HTRF受护者

XL665是从红藻类纯化的颜料,是HTRF技术的第一代。第二代D2类似于XL665但小得多。据说有时在TR-FRET系统中限制有时怀疑的空间障碍问题。


两个受体都在红色范围内发出。因此,它们的排放不太可能受到内在培养基或复合自发荧光的负面影响。两个红色受体都可以与铕或铽密码偶联。铽供体可以另外与绿色发射受体(例如荧光素)结合,允许潜在的复用(图2)。

HTRF检测

加密捐赠者通常在337nm处兴奋。受体和施主分别发射两种不同波长620nm和665nm。因此,它们可以彼此光学区分。620nm的发射是供体的适当排放,用作内部参考,而665nm的发射是受能量转移(结合事件)的指标(图3)。

激发和荧光检测之间60微秒的时间延迟消除了非特定的短寿命的背景发射。然后通常在400微秒的时间段内检测到发射(图4)。

然后执行在400微秒时间跨度上集成的两个发射通道的强度的比率(比率测量)。这常规信号,良好地校正到井变化或液体处理误差,并消除测定组件的培养基干扰和淬火。

HTRF技术的优点

均匀的时间分辨荧光很广泛受到浓郁,特别是因为其灵敏度和多功能性。时间分辨检测和比率测量的组合显着减少了背景并增加了负极信号之间的检测窗口。此外,镧系元素发射及时稳定,与不同的试剂和实验条件相容,并且不漂白。
除了它的敏感性外,另一个主要优点是它是均匀的测定。绑定的FRET供体 - 受体复合物的检测不需要与未结合组件的物理分离以减少背景。因此,HTRF技术不需要在分离或洗涤步骤之间,并且可以用简单的添加和读取协议(图5)执行。这最大限度地减少了处理步骤,并且比其他方法(如ELISA或Western Blot)更方便,更耗时。因此,它特别适用于自动化支持的筛选目的。德赢Vwin安全吗这是对药物发现和HTS采用的大量采用的原因之一。

但是,还存在限制。例如,通过与分子内激发过程或文库化合物或生物蛋白的荧光产生的外部相互作用产生的信号猝灭。[1]


HTRF板读者

HTRF测定的测量主要是对的微孔板读者。测定检测需要具有TRF检测模式的微孔板读取器,并且能够在顺序或同时运行一次测量两个发射通道。


由于该技术主要用于高通量药物筛查,HTRF板读数器应与384和1536孔板兼容。
HTRF读卡器基本设置包括用于波长选择的光源,激励和发射滤波器和光电倍增管(PMT)检测器。

光源:氙灯或激光

由于加密型复合物通常在337nm处激发,因此氙闪光灯或特定的激光激光可用作光源。一种TRF激光器在337nm处聚焦更多能量,并导致更好的结果,在低信号之间具有更好的歧视。


Pherastar FSX上的TRF激光器具有60赫兹的闪光灯频率为TR-FRET和HTRF的检测提供了显着的速度优势。它允许仅36秒测量全1536孔板,同时仍然保持Z'> 0.8,用于细胞和生物化学测定(图6)。这在应用笔记中被广泛讨论“在1536孔微孔板中测量的细胞和生物化学HTRF测定“。

专用探测器

Pherastar FSX HTS微孔板读卡器配备了所谓的光子计数PMT,用于时间分辨荧光检测。虽然通常微孔板读者在集成时间期间仅给出曲线下的区域的积分值,但是时间分辨的荧光 - 用光子计数检测监测镧系元素的整个衰减曲线。


在Pherastar.FSX.读取器,光子计数检测允许使用2微秒的时间分辨率测量和显示发射衰减曲线。这个独特的功能称为衰变曲线监测简化了时间分辨荧光测定的开发,有助于优化定时参数,从而改善检测和减少背景噪声。结合集成向导,衰减曲线监测提供了优化TR-FRET测定的平台。这些解决方案在测定的发展和运行内部TR-FRET测定时非常有用。


双通道排放检测

作为双波长发射测定,需要顺序或同时检测两个发射波长。通常,HTRF酶标读者在另一个之后测量两个信号。然而,两个通道的同时检测与顺序检测相比一些优点。


在Pherastar.FSX.,同时双发射(SDE)检测系统使用两个匹配的PMT,用于2个发射波长的并发测量,基本上减小板读取时间并增加吞吐量。由于良好卷,浓度或激发能量波动的差异,SDE也纠正了任何变化。与其他读卡器相比,这确保了改善的灵敏度和更低的CVS。然后将SDE单通道测量组合用于从两个发射通道的测量结果计算的比例计算。


HTRF认证

HTRF认证给出了S / N,DF%,CV%,灵敏度和动态范围方面满足CISBIO的规范。板式读卡器可通过白色或黑色酶标进行认证。通常,用黑微孔板认证是仪器较高灵敏度的指示。


以下BMG Labtech多德赢vwin官网客服模微型胶水板读卡器是Cisbio的HTRF:PherastarFSX.,Clariostar.,偏光乐欧米茄和Fluostar omega。

测定小型化

时间分辨荧光检测中的信号强度取决于浓度而不是在示踪剂的整体量上,因为它是例如放射性的情况。因此,可以在保持精度和再现性的同时缩小均相分辨的荧光测定。通过使用像Pherastar的高德赢Vwin安全吗度敏感的HTRF读卡器进一步支持这一点FSX.


测定镇压或小型化是药物筛查的关键步骤。其目标是减少样本量,以节省试剂和时间,同时保持可靠性,鲁棒性和再现性。虽然384和1536孔格式是最常用的,但甚至可以将其缩小到3456孔板。


在我们的科学谈话中“成功缩小筛选测定:服务器经验“,我们展示了使用Pherastar的案例研究FSX.高通量板读者显着导致HTRF测定的小型化从384到1536孔格式。在Pherastar.FSX.,测定小型化与“在一起”的检测(每孔只有一个闪光)和试剂的进一步稀释。这导致了高质量的Z'值和试剂使用和时间的显着降低。

HTRF测量和应用

可以应用均匀的时间分辨荧光技术,以分析细胞中的结合事件或在96,384和1536孔板形式中用于不同的生物学环境,例如蛋白质蛋白(配体 - 受体)和蛋白质DNA / RNA相互作用,GPCR信号,激酶,细胞因子和生物标志物。


另外,它适用于大多数基于细胞的方法,允许在细胞培养基存在下测量细胞裂解物。


HTRF技术在药物筛查界特别扩散。优点包括灵活性,可靠性,增加的测定灵敏度,较高吞吐量,较少的假阳性/假阴性结果。


蛋白质蛋白和蛋白质DNA / RNA相互作用

蛋白质蛋白和蛋白质核酸相互作用在细胞的几乎每种水平上发生。这包括膜蛋白通信(如受体 - 配体结合),信号转导(如G-蛋白质级联),基因表达调节,表皮遗传学(如组蛋白修改活动), 等等。


GPCRS.

G蛋白偶联受体(GPCR)测定可以分为两类,功能和机械测定。功能分析专注于像IP1或营地等次要信使的量化。作为信令级联的一部分,这些可以由特定抑制剂靶向,以使其在细胞中积累。第二信使可以用作读数,因为它们的浓度与受体接合和配体结合相关。这在应用笔记中显示了“用于功能筛选的HTRF IP-ONE测定“ 和 ”使用Cisbio的CAMP和IP1 HTRF HTPPLEL小区的测定测量GPCR激活“。


机械分析侧重于细胞膜对细胞的受体组织,特别是对受体寡聚化作为介导信号传导的手段。


激酶

也可以分析酶活性测定,例如激酶,蛋白酶,ubiquitination。夹心测定可用于测量基材的状态变化,如磷酸化。可以使用竞争测定来监测在反应中产生的其他产品,如ADP。


生物标志物

下游信号传导产品可用作生物标志物。它们的分析可以识别异常信号传导途径,可能在炎症,代谢和神经系统疾病中发挥重要作用。因此,基于HTRF的生物标志物分析可以用于测试特异性靶向这些疾病的化合物的功效。生物标志物分析的实例包括“人力蛋白质聚集的检测“在神经变性疾病中,”快速HTRF胰岛素测定的发展“对于代谢疾病,特别是糖尿病。

药物靶标有结合事件的动力学分析

在药物发现过程中,传统上仅在晚期时间点进行配体受体结合的动力学。这主要是因为技术困难和所提供的测定的相对低通量。

然而,优化受体结合动力学对于药物发现来说是非常有益的,因为结合和解离率对药物效率的影响和副作用的发生。此外,可以提高功效,并且可以延长动作的持续时间。最后,绑定动力学似乎在偏见的激动主义中发挥作用。


因此,希望在早期的时间点筛选筛选药物候选物,在迁移到体内模型和临床研究之前。

可以在微孔板读卡器上有效地进行结合动力学的研究,主要依赖于TR-FRET动力学检测用于筛选目的和低亲和力化合物的动力学研究(图7)。

Pherastar.FSX.具有独特的特点,致力于动态绑定研究,使其优于目前市场上的任何其他微孔板读者。在HTRF检测中具有高的时间分辨率,专用硬件和软件解决方案,PherastarFSX.容易解决绑定事件并计算关联和解离速率。

HTRF应用笔记

德赢vwin官网客服BMG Labtech使用HTRF测量出版了许多应用笔记。我们的HTRF读者包括Clariostar和本百合点FSX.和欧米茄系列。

参考

1. Degorce等人。“HTRF:针对药物发现量身定制的技术 - 了解理论方面和最近的应用。”目前的化学基因组学卷。3 22-32。5月28日。2009年

法律评论

HTRF.®是CISBIO的注册商标。

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