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HTS仪器发现肌醇磷酸(IP)信号通路的低亲和力抑制剂

EJ戴尔(1)JL TARDIEU(2)F Degorce(2) (1) 德赢vwin官网客服BMG实验室(2)Cisbio 02/2012
  • 仅由基于PMT的读卡器找到的几种低亲和力药物“命中”,而不是基于CCD的读卡器
  • Pherastar.®FS比基于ccd的阅读器快两倍
  • Pherastar.FS显示卓越的测定质量参数,如Z',Deltaf%和Assay窗口

介绍

g蛋白偶联受体(GPCRs)是一种跨膜蛋白,在细胞外刺激信号转导中起关键作用。GPCRs与一组复杂的细胞内蛋白组合有关,调节多种下游效应物。肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)的产生就是这样一种第二信使,它是响应gq耦合受体的激活而产生的。然而,IP3的半衰期很短,这使得它的评估对药物筛选分析太具有挑战性,而IP3触发的钙释放的监测已被广泛用作该信号通路的下游读出器。


监测IP3的另一种方法是测量IP3的下游代谢物肌醇一磷酸(IP1)的积累。

针对IP1的单克隆抗体提高了均匀时间分辨荧光分析(HTRF®),利用IP1稳定并在细胞中积累的优势。的HTRF®IP-One检测方法已与现有方法进行了比较,并已显示出类似的复合效价数据。此外,IP1的终点积累允许区分缓慢作用的化合物,仍然看不到钙敏感。的HTRF®IP-One检测还允许通过定量组成活性GPCRs来表征反向激动剂,这是不可能通过测量钙释放来实现的。最后,HTRF®与钙检测相比,IP-One检测赋予优异的测定稳健性和更低的假阳性率。Cisbio Bioassays开发的IP-One测定使用它们的专有HTRF®技术(图2)。

测定原则

该试验使用一种特异性识别IP1的单克隆抗体,它基于一种竞争形式,其中IP1细胞内积累抑制HTRF之间的荧光共振能量转移(FRET)信号®捐赠者和受体。IP1校准曲线可以估计在细胞中累积的IP1浓度作为化合物浓度的函数。


材料与方法

  • 下一代基于PMT的HTS Microplate Reader,PherastarFS
  • 来自其他供应商的基于CCD的微孔板成像仪

采用Greiner 1536孔微孔板,测定体积为5 μL。如图3所示,1408种不同的化合物被移液到微孔板的前44列,后4列分别为阳性(POS, n=64)和阴性(NEG, n=64)对照。的PHERAstarFS配备有高功率脉冲氮激光在337nm处发射,以及专用的同时双发射(SDE)直接光子计数时间分辨荧光模式。当激发铽(TB)供体分子时,激光器优于宽带氙闪光灯。与铕(EU)相比,激光器的能量排放利用铽峰峰值峰值达到337nm的较高分子消光系数。

成绩与讨论

结果由HTRF评估®两个发光波长(EM 665nm / Em 620nm)和命中的比率显示为表示整个1536孔微孔板的表面图中的峰。

表1:对pherstar的速度和检测质量进行了比较FS和基于CCD相机的HTS阅读器。

Pherastar.FS 基于CCD的高温超导阅读器
读时间(1536) 53秒 12分钟
测定窗口 6:1 2:1
Delta f% 490. 76.
Z'值 0.70 0.24

结论

的IP-One HTRF®Cisbio的检测采用两种不同的HTS酶标仪,采用不同的检测技术。低亲和力化合物没有发现与领先的HTS CCD相机的成像微孔板阅读器,很容易解决的PMT基于PHERAstarFS。这个下一代HTS读者,PherastarFS从BMG 德赢vwin官网客服Labtech表示HTS筛选测定的新选择。

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