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在荧光偏振屏幕中假阳性的识别

芭芭拉萨克蒂 MRC技术 07/2004
  • 在BMG Labtech微孔板读卡器上配置的荧光偏振屏德赢vwin官网客服
  • 快速检测假阳性
  • 鉴定干扰化合物和非特异性抑制剂

表的内容

介绍

荧光极化(FP)为筛选蛋白肽相互作用的抑制剂提供了一种有用的工具。


FP以均匀形式给出含有在结合状态中发现的肽比例的衡量标准。然而,对蛋白质的复合干扰和非特异性结构变化可以产生大量的误报,其仅在后期生化测定中鉴定。在筛选早期消除这些策略将加速击中流程。


在这里,我们从BMG Labtech微孔板读取器上的FP屏幕上呈现数据,用于与E2F肽的视网膜母细胞瘤肿瘤抑制德赢vwin官网客服蛋白(PRB)的相互作用。荧光素标记的E2F肽用于筛选10,000种小药物等分子。开发了基于荧光干扰和特异性的确认策略。

配置FP屏幕用于将重组PRB A / B结构与E2F肽的相互作用(如图1中的黄色描绘)。另外,将第二肽结合位点(E7为绿色),用作非特异性抑制剂的内部控制。荧光素-E7和Rhodamine-E2F标记的肽用于打击确认。


材料与方法

合成了多肽并进行了氟标记。使用前将肽溶解于测定缓冲液中(50 mM Tris HCl, pH 7.0, 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 0.05% NP-40)。图2显示了pRb与氟标记肽的典型滴定结合曲线(平均值±sem, n=3)。荧光素- e2f表现出最大的偏振度,因此是最好的信噪比。它被选为主屏幕的首选标签。使用Graphpad prism将数据拟合到一个单位点绑定模型。

对于荧光素和罗丹明标记的E2F计算的Kd值(450±70)nm和(380±50)nm,其与使用等温热量测定法测定未标记的肽的Kd。荧光素-E7与KD =(130±20)nm表示最紧密的结合。


该测定在384孔黑色板(基质)中优化,并使用Beckman FX液体处理机器人自动化。在50mM Tris HCl中,pH 7.0,100mM NaCl,10mM DTT,0.05%NP-40中的1μmPRB与40μm化合物(4%DMSO)和0.4μM荧光素-E2F(最终浓度)混合。总反应体积50μL。来自10,000种化合物的试验筛网的对照如图3所示。


德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板读取器设置

  • 荧光素检测:ex485 -12, em520 - 30nm
  • 罗丹明检测:ex 545-7, em580 -12 nm
  • 默认设置:闪烁50次,定位延迟1.0秒,1个周期

使用自由氟标记肽设定增益,使mP=35和k=1。


结果与讨论

来自荧光素-E2F的偏振和去极化信号,具有和不具有PRB的存在,如图3所示(分别是固体和开口蓝色圆圈)。还显示了通过E2F蛋白和肽结合的特异性破坏。

E2F蛋白的加入完全取代了Fl-E2F(红色开三角),信号降低为单独的氟肽信号。未标记的e2f肽(固体红钻石)在50%的抑制浓度下明显地与对照种群分离。Hits被鉴定为将极化信号降低到低于荧光素- e2f: pRb控制的平均值-3sd的化合物。表1显示了屏幕数据的摘要。


表1:屏幕数据摘要。

试验参数

噪音信号:

信号:背景

Z”

6.9

4.8

0.67

测试屏幕10,000.

Z”

命中率

0.45

0.93%

从初级筛网中选择的次数(37.5%)是有色化合物,其显着改变了荧光强度信号,并且可能会对测定进行干扰。所有命中均包含在命中确认测定中。

从母血股和荧光素-E2F和罗丹明-E2F重新调整命中。观察到荧光素-E2F和罗丹明-E2f抑制之间的相关性(R2 = 0.69)(图4),击中确认率为78%。值得注意的是,60%的化合物可能干扰荧光素信号是罗丹明-E2F测定的抑制剂,而不影响罗丹明荧光强度信号。表明在荧光干扰的基础上取消选择化合物可导致实际抑制剂的丧失。


最后,在400nm处针对第二肽结合位点进行荧光素-E7肽测试令人兴奋剂,如图5所示。将结果与E2F的抑制进行比较,并且示出了散射图。

观察到较弱的相关性(r2=0.51), 72%的E2F抑制剂也抑制荧光素- e7。这些化合物被排除为非特异性抑制剂,并没有在随后的生化分析中继续进行。14个点击是从主屏幕中确定的总共80个点击中前进的。


结论

荧光素- e2f与pRb的结合比罗丹明- e2f的结合极化程度更高,因此可以获得更好的信噪比和Z’因子。它是首选的主屏幕标签。


筛选对第二肽位点E7,鉴定的非特异性抑制剂筛选,这导致蛋白质的结构性变化。罗丹明-E2F和荧光素-E7的组合在相同允许的特异性抑制剂的快速选择中,最小化试剂使用。这些非特异性抑制剂的鉴定显着降低了下游工作负荷。

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