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用BMG LABTECH微孔板读卡器定量的荧光标记吞噬目标的内化德赢vwin官网客服

阿比盖尔·泰勒·路易斯·唐纳利 伦敦帝国理工学院国家心肺研究所 05/2007
  • 荧光标记的聚苯乙烯珠被用作吞噬研究的目标
  • 使用BMG LABTECH微孔板阅读器进行内化量化德赢vwin官网客服
  • 衍生自血单核细胞的巨噬细胞用作检查肺泡巨噬细胞功能的模型

表的内容

介绍

吞噬作用是高等真核生物先天免疫系统的重要组成部分。它涉及摄入和破坏潜在的致病或炎症颗粒,如微生物、凋亡细胞和矿物质。在人类中,吞噬是通过识别外来颗粒而启动的,这可以通过两种机制之一发生。第一个是直接识别微生物表面分子结构的重复模式,如革兰氏阴性细菌外壳蛋白、脂多糖(LPS)和热休克蛋白-60 (HSP-60)。


或者,病原体可以通过识别血清中的体液成分来间接检测,这些体液成分与病原体的表面结合,这一过程称为调理。所涉及的调理蛋白包括分别被Fc和C3b或C3bi受体识别的抗体和补体蛋白。识别后,目标被内化为细胞内的吞噬体。然后与溶酶体融合,溶酶体释放蛋白酶,催化颗粒的分解。

肺泡巨噬细胞(AM)颗粒和微生物的吞噬作用是一种必需的肺宿主防御机制。在慢性肺部疾病(如慢性阻塞性肺疾病(COPD),所有病理生理学变化都被认为是由巨噬细胞介导的。然而,研究肺中病原体间隙的过程很困难,因为从支气管肺泡灌洗(BAL)中获得可行的am是可变的。相反,容易获得血细胞,因此可以使用血液巨噬细胞模型来检查AM功能。巨噬细胞衍生自单核细胞,其可以与外周血单核细胞(PBMC)分离。单核细胞对巨噬细胞的分化发生在7-21天内。


吞噬作用的测量传统上涉及显微镜、流式细胞术分析或放射性测定;所有这些都是耗时的,如果是后者,则需要额外的安全程序。在本研究中,使用BMG LABTECH微孔板读取器对单核德赢vwin官网客服细胞源性巨噬细胞(MDM)荧光标记吞噬目标的内化进行了量化研究。
该BMG德赢vwin官网客服 LABTECH阅读器能够在用户定义的温度下进行多次读数,也可以配备智能点胶注射。

材料与方法

  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板阅读器
  • 黑色96井清澈的底部培养和测定板(FisherScientific)
  • 荧光标记聚苯乙烯珠(2 μm,羧酸修饰黄绿色,Invitrogen)
  • 不连续的Percoll梯度(Amersham Biosciences)
  • 单核细胞隔离套件II(Miltenyi Biotec)
  • 粒细胞巨噬细胞殖民地刺激因子(GM-CSF,BioSource)
  • 台盼蓝(Sigma-Aldrich)

使用葡聚糖沉淀,不连续的栓塞梯度和单核细胞分离试剂盒II从非莫克者获得的全血中分离单核细胞。将它们用2ng / ml GM-CSF培养在黑色96孔透明底皮培养板上12天。此后,单核细胞已与类似巨噬细胞样表型分化。


肺泡巨噬细胞(AM)与正在进行调查支气管镜检查的非吸烟患者中分离出来。肺部用温盐水灌洗,然后使用纤维光支气管检索。洗涤细胞并重新悬浮在培养基中,然后在黑色96孔透明底板上培养。两种细胞,MDM和AM都是强烈粘附的。


用荧光标记的聚苯乙烯珠(2μm, 50x10)进行吞噬实验6珠子/毫升)。巨噬细胞(MDM或AM)与微珠孵育4h,然后洗去未结合的颗粒。细胞外荧光用台盼蓝淬灭。在BMG LABTECH微孔板阅读器上,在480 nm激发,520 nm发射,测量内嵌微珠的荧光。德赢vwin官网客服为了确认颗粒的内化,还使用共聚焦显微镜观察细胞。细胞核用DAPI染色,细胞质用Evans蓝染色。

结果与讨论

为了建立吞噬作用测定的最佳孵育时间,将MDM分离,用荧光聚苯乙烯珠子孵育2,4和6H。使用BMG Labtech微孔板读卡器定量摄入珠粒的荧光。德赢vwin官网客服这些实验表明MDM可以以时间依赖性方式吞噬荧光标记的聚苯乙烯珠粒(图1)。

为了确定用于吞噬实验的最佳珠子浓度,MDM被置于0.5-50x10的溶液中孵育6珠子/毫升。荧光标记聚苯乙烯珠的吞噬作用以浓度依赖的方式增加(图2)。

为了确认珠子被内化并且不粘附在细胞表面上,MDM在腔室中培养并在增加浓度下与聚苯乙烯珠孵育。然后使用共聚焦显微镜观察这些幻灯片。依次通过细胞逐渐拍摄的图像显示珠子完全在细胞细胞质内(未示出的图像)。另外,图像验证了噬粒浓度的吞噬作用依赖性增加。为了确保在肺衍生的巨噬细胞中观察到的MDM吞噬作用,进行了使用肺泡巨噬细胞(AM)的比较实验。MDM和AM用珠子孵育,使用BMG Labtech微孔板读卡器测量吞噬作用(图3)。德赢vwin官网客服

结论

此处提出的发现表明MDM可以以与肺泡巨噬细胞相当的方式吞噬吞噬糖蛋白珠,因此是研究吞噬作用的合适模型。BMG 德赢vwin官网客服Labtech微孔板读卡器提供准确,一致的方法,用于量化巨噬细胞吞噬作用,其比以前采用的方法更高的时间效率明显更多。

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