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用色氨酸荧光的抗氨基酸抗体立体选择性研究

Danielle M. Corliano Heike Hofstetter Oliver Hofstetter 北伊利诺伊州大学 11/2007
  • 内在色氨酸的变化For荧光用于测量抗体与其抗原的结合
  • 立体选择性抗体标定与氨基酸的D-映体结合
  • pH,温度和浓度对固有色氨酸的影响

介绍

已知诸如抗体如抗体的蛋白质的结合位点通常含有色氨酸(TRP)残基,其流动性质可以在配体结合时改变。结合位点内的构象变化或仅存在配体的存在可以导致FOORESPEC淬火或增强,其可用于定量研究蛋白质 - 配体相互作用。对氨基酸的高度立体选择抗体已用于各种分析技术,用于敏感对映体杂质和对映体分离的敏感性检测。本研究的目的是测试色氨酸流荧光是否可用于确定抗D-氨基酸抗体朝向各种标准和非标准氨基酸的AFI。


为了检查BMG Labtech微孔板读取器的效用测量TRP FOR荧光德赢vwin官网客服(图1),使用游离氨基酸作为分析物优化实验条件。

材料与方法

  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器
  • Reacti-Tend白色不透明96孔板(Pierce)
  • D,L-色氨酸(Sigma)
  • D-苯丙氨酸(Sigma),L-phenylanine(Sigma)
  • 磷酸盐缓冲液(2和12之间的pH值)
  • 单克隆抗D-氨基酸抗体

在PBS / 0.05%Tween 20(250μl/孔37℃)中,在PBS / 0.05%Tween 20中封闭96孔微量滴定板,然后用PBS / 0.05%Tween 20洗涤。含有TRP的样品(200μL/孔)或在280nm下激发磷酸盐缓冲液(100μl/孔)中不同浓度的抗体;在350nm中检测到发射。对于配体结合研究,在FOOR伯爵测量之前,在室温下,在室温下将50μL/孔的抗体在室温下预孵育2小时,在FORescescescess测量之前,具有不同浓度(50μl/孔)。

成绩与讨论

研究了分析物浓度,温度和pH的效果,以便建立与BMG Labtech微孔板读数器一起使用的最佳条件。德赢vwin官网客服如图1所示。如图2所示,在约1mM和1μm的浓度范围内观察到TRP FOOR荧光的透明浓度依赖性增加。在280nm的激发时获得具有最小背景流的优异信噪比,并在350nm处检测FOORESPE发射。相反,在相同的浓度范围内的苯丙氨酸(未示出),在苯丙氨酸(未示出)中没有观察到FOOR荧光。

使用TRP以70μm作为分析物的TRP研究了温度和pH的效果。如图1所示。如图3所示,FOR荧光强度在较高温度下显着降低。

对pH的变化也对TRP FLORESPEACE具有相当大的影响,这在pH约11时最强(图4)。这两项结果与先前的报告吻合良好。

通过测量TRP FOR FOR荧光来研究抗体立体选择性

如图1所示。如图5所示,BMG Labtech德赢vwin官网客服板读数器可用于确定本研究中使用的抗D-氨基酸抗体的内在TRP FOR荧光。在磷酸盐缓冲液中,pH7.4中的抗体浓度增加导致在280nm的激发时在350nm下提高流动发射。

对于蛋白质 - 配体研究,将抗体的固定浓度与各种氨基酸的D-或L-对映体一起温育。图。图6分别显示了用D-和L-苯丙氨酸获得的结果。

虽然抗体与D-PHE的相互作用导致抗体的内在TRP流荧光的浓度依赖性增加,但不使用L-映体观察这种效果。通过环己氨氨酸,组氨酸,NORLELININE,亮氨酸和诺韦林(未示出)的对映体获得了类似的结果。在所有情况下,抗体与这些氨基酸的D-对映体的立体选择性相互作用导致蛋白质的内在TRP FOR度的浓度依赖性增强,而L-对映体不会导致FOR荧光的变化。如使用其他分析技术所观察到的,抗体的AFFINIS最强于具有芳族或庞大的侧链的D-氨基酸,而脂族氨基酸呈更弱。


结论

BMG 德赢vwin官网客服Labtech酶标器读卡器允许测量具有高灵敏度和良好信噪比的TRP FLORES。在280nm处的适当蛋白质的激发和350nm处的FOR荧光发射的测量可用于研究蛋白质 - 配体相互作用,并推导例如结合AF 5。

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