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离子通道测定使用Invitrogen的FRET系列电压传感器探头开发

Randall L. Hoffman Steve Duff Naveeda Qadir Invitrogen Corporation 10/2005
  • 用于离子通道测定开发
  • 同时双发射检测的FRET
  • 同时注射和褶皱测量

表的内容

介绍

离子通道是重要的药物靶标,因为它们在神经,心脏,内分泌和骨骼肌组织中的关键作用。缺乏足够敏感的筛选系统在该地区受到阻碍的研究。本申请说明专注于电压传感器探针(VSP),荧光共振能量转移(FRET)基于Invitrogen的用于测量蜂窝膜电位的变化。


这种技术能够检测和测量膜电压的快速变化,并迅速报告它们作为活细胞的荧光信号。比率测量法用于检测和量化细胞膜电位的变化,显著减少了由于细胞数量、染料负载和信号强度、平板不一致和温度波动等各井间变化而产生的误差。这些结合的特点使VSP技术高度适用于高通量筛选(HTS)应用。


本应用笔记演示了使用BMG LABTECH微孔板阅读器开发VSP离子通道分析。德赢vwin官网客服

测定原理

VSP是一种基于荧光共振能量转移(FRET)的测定技术,用于离子通道药物发现。FRET供体是一种膜结合的香豆素 - 磷脂(CC2-DMPE),其仅结合到细胞膜的外部。FRET接受者是一种移动,带负电,疏水的氧代洛尼醇[不接受2(3)或不采用4.(3)],其响应于膜电位的变化而与质膜的任一侧结合。休息细胞具有相对负电位,因此两个探针与细胞膜的外部相关联,导致有效的褶皱(图1)。激励CC2-DMPE供体探针(过滤器:400-10nm)从Oxonol受体探针产生强大的红色荧光信号(过滤器:570-20nm)。


当膜电位变得更正时,oxonol探针迅速(在亚秒的时间范围内)转移到膜的另一边。因此,每一个oxonol探针“感知”细胞中的电压变化并作出反应。


该易位将FRET对分开,因此激励CC2-DMPE供体探针,并从CC2-DMPE探针产生强大的蓝色荧光信号(过滤器:460-10nm)。

我们使用的离子通道模型是内源性表达在大鼠嗜碱性白血病细胞中存在的内源性整流钾(KIR)通道。当高钾加入到细胞培养基中时,这些通道打开。这导致可以通过氯化钡调节的细胞膜电位的变化。在测定中,如下所述用染料手动地装载细胞。然后立即以各种浓度加入氯化钡。孵育后,将电镀细胞放置在读取器中。读者开始在两个波长下拍摄基线读数,注射高钾缓冲液(下面的VSP-2缓冲液),并继续拍摄指定时间的读数。


材料与方法

细胞培养
RBL-2H3(大鼠嗜碱性白血病,ATCC)细胞在实验程序前18-24小时在Corning®96孔板中以50,000个细胞/孔。


VSP加载缓冲器的制备

A.5μMCC2-DMPE加载缓冲液:预混物10μl5mMCC2-DMPE(Invitrogen)和10μl100mg/ ml pluronic®f - 127(σ)。加入10毫升VSP溶液1(160毫米氯化钠,4.5毫米氯化钾,2毫米氯化钙2, 1毫米MgCl2, 10毫米葡萄糖,10毫米HEPES, pH 7.4)和涡流大力混合。使用前要避光。
B.10μm分布2(3)装料缓冲液:预混8.3 μL的12 mM DiSBAC2(3) (Invitrogen)和(12.5 μL 200mm vabs -1)。加入10毫升VSP溶液1,用力搅拌。

加载细胞
用100 μL VSP Solution 1 (VSP-1)替代培养基。立即用100 μL CC2- DMPE装药缓冲液替换VSP-1,室温孵育30min,加盖避光。30分钟后取出CC2-DMPE载板缓冲液,100 μL vp -1洗涤1次。立即用100 μL DiSBAC替换sp -12加载缓冲液并在室温下孵育30分钟,覆盖和免受光线的保护。


Bacl.2(Sigma)在适当的情况下,立即添加了不分数后2加载缓冲液或在VSP-2高K +缓冲液之前立即(164.5mm KCl,2 mm Cacl2, 1毫米MgCl2,10毫米葡萄糖,10 mm Hepes,pH 7.4)。


结果与讨论

立即遵循分数2加载缓冲液孵育30分钟,在板上分析BMG LABTECH微孔板阅读器。德赢vwin官网客服通过(Ro)和(Rf)加入vpp -2前后的供体(460 nm)与受体(570 nm)的基线减比来分析数据:最终归一化的分析比= Rf/Ro。图2A显示96孔板、50,000 RBL细胞/孔的“阳性对照”试验的板读出视图。第1列是no cells控件。使用前要避光。

在图2B中,无细胞对照的当前状态窗口显示,加入vpp -2后,460 nm信号没有变化,而在图2C中,检测到注射vpp -2后460 nm信号增加。图2D显示了12个BaCl2剂量反应孔当前状态窗口的放大视图。注意,在细胞控制和12.5 mM BaCl中缺乏460 nm的发射增加2与未经处理的井相比。

在Excel中评价原料荧光读数,并加入12.5mm Bacl2避免了460nm发射的显着变化(图3a),而未处理的控制孔显示在VSP-2添加时460nm荧光信号的预期增加(图3b)。


结论

本应用笔记演示了电压传感器探头技术与BMG LABTECH的读板器的兼容性。德赢vwin官网客服这项技术的关键是拥有能够同时测量两个波长的仪器。这利用了比率法的FRET读出,这大大减少了许多基于细胞的分析常见的变异。BMG LABTECH阅读器的能力注入德赢vwin官网客服通道刺激物,开关滤波器约1hz,并在动力学事件期间继续进行读数,使这些仪器适合离子通道分析。

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