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无标签SoPRano金纳米棒(GNR)的分析,基于光谱的微孔板阅读器

EJ戴尔(1)Meike Roskamp(2)Frederik Van de Velde(2) (1)B德赢vwin官网客服MG Labtech(2)Pharmadiagnostics 12/2014
  • Soprano™无标签测定需要全谱分析
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  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech发光读卡器用于监测剂量依赖性响应

表的内容

介绍

无标签SoPRano™金纳米棒(GNR)试剂盒使用户能够设计和运行无标签,微板为基础的高质量的蛋白质相互作用分析基于局部表面等离子体共振(LSPR)。配体与表面固定化蛋白的相互作用导致浓度依赖性和高重复性的GNR LSPR峰红移。使用BMG LABTECH的基于谱仪的酶标仪,捕获了全光谱,并显示了信号的特异性。德赢vwin官网客服人血清白蛋白(hSA)和牛血清白蛋白(bSA)分别偶联到SoPRano™GNRs,它们各自的单克隆抗体在不同浓度下结合。


测定原理

基于折射率变化的检测,Soprano™平台能够监测粘合事件(例如两种蛋白质之间)。该技术的基于LSPR(局部表面等离子体共振)的技术是对广泛使用的SPR技术的适应性。


这个怎么运作:

  • 将您的蛋白质缀合到金纳米棒(GNR)。
  • 捕捉gnr -蛋白缀合物的全吸收光谱以确定λmax,因为每个gnr -蛋白缀合物都是不同的。
  • 将蛋白质配体添加到gnr -蛋白质偶联物中,并测量全光谱。当蛋白配体与共轭蛋白发生特定的相互作用时,λmax会发生剂量依赖性的红移。
  • 相互作用时频谱的这种变化是由于GNR表面处的局部折射率的变化并且是非常可再现的。
  • 对于动力学测量,3000秒内每10秒进行一次全光谱测量。对于慢速动力学,测量可能需要更长的时间;对于快速动力学,可能需要更频繁地进行测量。

材料与方法

  • BSA,HSA及其相应的单克隆抗体购自Abcam(United Kingdom)Soprano™套件来自Pharma Diagnostics Soprano™套件来自Pharma诊断(比利时)
  • 不binding, 384孔,黑色微孔板,底部透明,来自Greiner(德国)

使用EDC和磺基-NHS通过蛋白质的游离胺单独缀合BSA和HSA与金纳米棒(GNR)缀合(见图2)。

增加抗体的量(5µL, 16倍浓度)与偶联GNRs(40µL)孵育50分钟(使用MES缓冲液35µL使最终体积达到80µL),然后进行全谱测量。利用MARS数据分析软件和计算模板,可以很容易地进行比值分析(∆Ru = λmax +80 nm/ λmax),并确定与其他分析方法相对应的Kds。


结果与讨论

使用单位结合模型,为HSA-GNR及其抗体(图3)和BSAGNR及其抗体产生剂量响应曲线(图4)。

使用相反的抗体为该系统,交叉反应显示不发生。信噪比(S:N)大于24,Z′因子大于0.80,证明这是一个稳健的和可重复的系统。计算得到的Kds与预期结果一致。


在完全的光谱测量中,创建了从全光谱测量产生与不同浓度的HSA抗体结合的HSA-GNR的动力学曲线。在达到平衡时,使用单位双曲线结合和最后一次动力学周期,可以产生剂量响应曲线,其给出粘合常数Kd(未示出)。动力学测量用于通过MARS数据分析软件中的结合动力学方程产生关联(KA)和解离(KD)速率。

结论

来自Pharma Diagnostics的免费SOPRANO™平台使能高通量,基于板的均质LSPR测定来测定蛋白质 - 蛋白质相互作用。基于光谱仪的微孔板读者来自BMG Labtech的全光谱在每孔不到一秒钟内。德赢vwin官网客服Soprano™测定需要全光谱,以确定结合时λmax的偏移。随后,火星数据分析软件容易允许该测定所需的比例分析。

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