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用于使用基于吸光度的比色读数检测SARS-COV-2 RNA的灯测定

Ann-Cathrin Volz,Martin Mangold 德赢vwin官网客服BMG LABTECH 77799,德国奥尔滕贝格 03/2021
  • 灯测定使用比色变化的实时检测作为病毒RNA扩增的量度
  • BMG LABTECH的Omega系列具有65°C的加热德赢vwin官网客服能力,能够实时孵化和分析LAMP分析,并在建立新分析时识别理想的切断点
  • 紫外/可见光谱仪能够同时读出2个或更多波长,允许快速读取时间,最大限度地增加可能的动力学间隔的数量

表的内容

介绍

快速分子诊断测试是检测的中央工具,从而减缓传染病的传播。SARS-COV-2大流行促使国际努力在可用的测试方法上创造和扩展。逆转录回归介导的等温缩放(RT灯)测定通过几种不同的序列识别靶RNA,并用高选择性扩增它1。LAMP检测与基于PCR的方法具有相当的敏感性和特异性2。与PCR相比,LAMP检测基于Bst聚合酶而不是Taq聚合酶。Bst聚合酶及其链置换活性在65°C时工作最佳,这意味着LAMP实验可以在65°C等温条件下进行3.。由于省去了温度循环的需要,检测时间缩短到大约30分钟1该分析可以在加热至65°C的平板阅读器上运行。


因此,灯测定作为快速诊断方法提供了在高吞吐量中工作的机会,以增加诊断能力作为PCR技术的替代或补充。

测定原理

在LAMP实验中,嗜热的Bst聚合酶和引物集合,识别不同位置的SARS-CoV-2核酸序列(图。1).如果用LAMP法扩增目标核酸,释放氢离子,使样品pH向酸性方向移动。含ph敏感染料,用于检测吸光度模式。在415nm处的吸光度OD的增加和pH敏感染料的560nm的降低,检测到放大器。在阳性(POS。)样品中,预计该pH转移将在灯泡测定的开始孵育后30分钟内发生。

材料与方法

实验程序
Flyostar omega预热到65℃2.5 h后孵育LAMP试验。将LAMP检测试剂盒中的阳性对照(n-基因)用无核酸酶水1:10稀释至10万拷贝/µL。比色LAMP反应的最终反应体积为5µL(见4)。LAMP检测试剂盒各组分的浓度按厂家说明书使用。将混合料、引物、盐酸胍、无核酸酶水和模板预混合,移入黑色384孔板,400 g离心1 min。LAMP检测样品为4个重复。样品分布在平板上。用qPCR密封器密封板,然后使用以下设置在FLUOstar Omega上读取,读取板的周期时间基于完整的384孔板:

仪器设置

视镜设置 吸光度,平板模式动力学
谱仪 415 nm.
560海里
常规设置(最快) 数量的闪光 22.
沉淀时间 0.0秒
动态设置 周期数 27.
周期 133年代
孵化 65℃
摇晃 双轨道,600 rpm 30 s,循环1,6和11

数据分析
使用415nm和560nm(ΔOd)的吸光度之间的差异来分析孵育时间上的pH敏感颜色变化2。计算单个信号曲线的时间到最大斜率,以区分在FLUOstar Omega内的正、负(负)控制火星的软件

结果与讨论

评估核酸的放大阳离子,POS的ΔOd。和否定。在60分钟(FI G.2)的时间内监测对照。对于POS观察到ΔOD的大幅增加。在灯泡测定开始后约18分钟控制。POS中的ΔOD的这种增加。控制在各个复制井和测试运行中相对地发生。neg。控制也显示出ΔOD的增加,然而,此变化稍后发生,并且显示出较低的坡度和井中的变化更高。

neg中ΔOd的变化。井是杂散的放大器产品的结果 - 灯测定中的众所周知的事件。对放大器的实时监控允许定义理想的测量窗口以区分POS。来自否定。样品(橙色框架,fi g.2)。区分POS。和否定。样品,各个曲线的时间 - 最大斜率可以用作评估在特定时间点(FI G.3)的ΔOD的替代方法。虽然pos。控制达到最大值。 slope after about 19 min, neg. control samples need about 39 min. This measurement can be applied using the MARS software supplied with the instrument.

结论

德赢vwin官网客服BMG LABTECH的Omega系列适用于在65°C下运行比色LAMP检测,同时实时检测RNA扩增。ph值随时间变化的实时测量使用户对数据有信心,并且在建立新的分析方法时有助于理解区分阳性和阴性的最佳截断点。样本。该光谱仪在415 nm和560 nm同时检测,允许每384孔板2分钟13秒的周期时间,提供频繁的时间点被测量。与仪器一起提供的FDA CFR-21第11部分批准的MARS软件便于自动计算∆OD和最大斜率的时间,允许用户区分位置和阴性。容易控制。使用酶标仪上的LAMP检测,用户能够在40分钟内检测样品,使该技术非常适合作为高通量诊断工具。

参考文献

1.Notomi, T等。DNA的环介导等温扩增,核酸研究,doi: 10.1093/nar/28.12。e6320001(2000)。
2.Thi, VLD等。临床样本中检测SARS-CoV-2 RNA的比色RT-LAMP方法和lamp测序,Sci Transl Med. doi: 10.1126/scitranslmed。abc7075 (2020)
3。https://international.neb.com/m0538;https://international.neb.com/E2019
4. Crone,Ma等。自动化SARS-COV-2临床诊断的快速发展和验证的生物福音术中的作用,NAT Commun,DOI:10.1038 / S41467-
020-18130-3 (2020)

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