LanthaScreen技术

时间分辨 - 荧光共振能量转移(TR-FRET.)是药物发现实验室首选的荧光分析格式。TR-FRET法比其他方法更不容易受到复合干扰,可以应用于多个目标类别。为了支德赢Vwin安全吗持这一技术焦点,生命科技公司开发了LanthaScreenTM生物化学和细胞测定以测量激酶活性,复合结合和翻译后修饰事件,例如细胞信号传导中的磷酸化和底物的乙酰化。lanthascreenTM分析利用铽和铕螯合物作为焦躁供体。铽螯合物被用作荧光素和GFP的供体,铕螯合物是Alexa Fluor的供体®647.

LanthaScreen™激酶活性测定格式基于使用寿命较长的铽或铕螯合物作为供体物种和荧光素作为受体物种。当铽和荧光素标记的分子靠近时,能量转移发生,导致受体荧光增加,供体荧光减少。trf - fret值是用520 nm滤光片测量的fret信号与495 nm滤光片测量的信号的比值来确定的,495 nm滤光片测量的信号针对铽。

图1:Lanthascreen的示意图®使用传统肽基材的激酶活性测定。将荧光素标记的激酶底物肽与激酶和ATP一起温育。然后加入铽或铕标记的抗体并通过TR-FRET值的增加检测磷酸化。因为基材直接标记,所以无需添加链霉蛋白-APC。此外,与其他基于铕的系统不同,不需要增加高浓度的氟化钾,这可能会破坏抗体 - 产品相互作用。

在兰花斯科登激酶试验,激酶,荧光素标记的基底和ATP被允许反应。然后加入EDTA(为了停止反应)和铽标记的抗体(以检测磷酸化产物)。在镧激酶激酶反应中,抗体与磷酸化的荧光素标记的基底相关,导致Tr-Fret值增加。与示踪剂结合的抗体量与存在的磷酸化底物的量成比例,并且以这种方式,可以通过增加Tr-Fret值的增加来检测和测量激酶活性。

图2:lanthscreen原理图®细胞测定

该分析格式的原理和方法很简单:

  • 1.作为gfp融合蛋白表达的激酶底物的磷酸化可以用激动剂刺激激活该通路,也可以用抑制剂处理以中断信号传递事件。未受刺激的细胞中不会发生蛋白质修饰。
  • 2.细胞在含有tb标记的磷酸化位点特异性抗体的缓冲液中裂解。蛋白质修饰事件的检测是在一个trf - fret兼容的平板阅读器上进行的。在未受刺激或受抑制的细胞中观察到很少或没有TR-FRET,而受刺激的细胞样本显示出较高的TR-FRET。

申请笔记

参见我们的LanthaScreen应用说明:

有关Lanthascreen的更多信息®以及生命科技公司提供的相关化验访问他们的网站

去顶级