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Lanthascreen Tr-Fret酪氨酸激酶和蛋白激酶C测定

Randy Hoffman(1)Megan Buros(1)Kevin Kupcho(1)ej戴尔(2) (1)Invitrogen(2)BMG德赢vwin官网客服 Labtech 12/2014
  • 使用专用视镜设置的铽和FL Uoutcein的双波长检测
  • 强硬持久的捐赠信号最小化背景
  • PKC和酪氨酸激酶活性的快速可靠地检测

介绍

蛋白激酶C(PKC)酶是一种多样的酶系列,即在丝氨酸和苏氨氨基酸上磷酸化蛋白质的特定信号传导条件下。PKCs are involved in many cellular functions including neuronal activity, cell growth, cell proliferation, and cell movement, as well as in several diseases including cardiovascular, cancer, diabetes, and Alzheimer’s.Therefore a TR-FRET screening assay, such as the one described here, can aid in further elucidating PKC’s function.


酪氨酸激酶(TKS)是各种各样的酶系列,其在氨基酸酪氨酸上磷酸化蛋白质的特定信号传导条件下。TKS涉及许多细胞功能,例如细胞分裂和细胞增殖,以及包括癌症和糖尿病在内的几种疾病。酪氨酸激酶在细胞生长中起重要作用,从而使其成为癌症治疗中的重要药物靶标。因此,如本文所述的Tr-FRET筛选测定,可以帮助阐明酪氨酸激酶的标本抑制剂。

测定原则

将具有酪氨酸激酶和ATP孵育的FL Uoratcein标记的聚-GT或Poly-Gat(Glu,Ala,Tyr)底物。对于蛋白质激酶C测定,与PKC和ATP一起孵育标记的PKC基质的FL Uoutcein in。随后,加入与磷酸化的底物形式结合的铽标记的抗体。当抗体与磷酸化底物相互作用时,在铽标记(在490nm发射)和Fl uoutcein部分(在520nm时发射)之间会发生褶皱(图1)。

测量以490和520nm拍摄,并且绘制520/490比与酶浓度确定EC50.用于酶及其基材。

材料与方法

  • Invitrogen的荧光素PKC底物和PKC激酶缓冲液(5X),PKCα,激酶骤冷缓冲液
  • Invitrogen的Lanthascreen™TB-PKC底物抗体
  • Invitrogen的荧光素-Poly-GT和荧光素 - 多GAT,酪氨酸激酶缓冲液,ZAP70,筛选稀释缓冲液
  • Invitrogen的Lanthascreen®TB-PY20抗体
  • 黑色康宁®低体积384孔孔孔板

PKC滴定
滴定多种PKC同种型以确定用于筛选的最佳激酶浓度。以下协议是用于确定EC的条件的示例50.PKCα及其基材。在2.0μg/ ml的浓度为2.0μg/ ml的浓度下,在250nm Fl u'torecein标记的P​​KC基板的存在下,在微孔板中的总体积为10μl的情况下,将稀释系列PKCα。在室温下孵育90分钟后,加入10μl含有2x EDTA(20mM)和2×TB-PKC抗体(1.0nm)的TR-FRET稀释缓冲液并混合,以产生每孔20μl的卷积,1X 1X EDTA浓度为10mm,最终1x抗体浓度为0.5nm。在室温下孵育60分钟后,在BMG Labtech微孔板读卡器上读取板。德赢vwin官网客服每个数据点代表三个井的平均值。


酪氨酸激酶滴定
展示普遍酪氨酸的功能激酶测定使用Lanthascreen™,Fl Uoratein-poly-gat(glu,Ala,Tyr)和Fl Uoutcein-poly-gt(glu,Tyr)衬底与铽标记的py20抗体一起使用。


将稀释系列激酶与400nm Fl u'tecein标记的基材一起温育,在微孔板中的总体积为10μl的200μmATP。在室温下温育60分钟后,加入5μL含有4x EDTA(60mM)的TR-FRET稀释缓冲液。接下来,加入5μL具有4倍抗体(8nm)的Tr-Fret稀释缓冲液并混合以产生每孔的20μl体积为20μl,浓度为15mm,浓度为2nm的固定1x抗体浓度。在室温下孵育60分钟后,在微孔板读卡器中读取板。

仪器设置

Flyostar / Polartar Omega Clariostar. Pherastar.FS.
检测模式 时间分辨荧光
方法 端点,顶级视镜
视镜设置 高级TRF.
光学头
外滤波器:TREX
EM-Filtera:EM520
EM-FILTERB:490-10
ex-filter:ex tr
EM-Filtera:520-10
EM-FILTERB:490-10
lanthascreen
光学模块:337 520 490
集成开始 100μs.
集成时间 200μs.

成绩与讨论

图2显示了PKCα和PKC1的代表性激酶滴定曲线。

表1显示了测试的所有激酶的统计数据。

表1:Pherastar上的Lanthascreen™:PKC同种型滴定的统计数据。

PKCα. pkcßi. pkcßii. PKCD. pkcε. PKCO PKCζ.
EC.50.(ng / ml) 0.43 0.27 0.22 0.07 0.03 0.16 0.12
分钟。价值 0.44 0.43 0.79 0.55 0.73 1.02 0.84
最大限度。价值 2.69 2.66 2.61 2.64 2.63 2.63 2.63
Max-min. 2.25 2.23 1.82 2.09 1.90 1.61 1.79
折叠差异(max / min) 6.1 6.2 3.3 4.8 3.6 2.6 3.1
山坡坡 1.1 0.89 1.01 0.70 0.93 0.96 0.83
R.2 0.991. 0.996. 0.988 0.979 0.988 0.976 0.982
S:N. 60. 47. 18. 31. 25. 14. 18.
Z'系元素值 0.94 0.91 0.78 0.87 0.85 0.74 0.79

所有PKC同工酶以与PKCα类似的方式滴定。无论“折叠差异”或信噪比比,所有测定都提供Z'值远远大于0.5。这是由于使用FRET的比例数据分析,这导致重复的低标准偏差。山坡和r2测量落在可接受的限度范围内。R.2接近1.0的值表示完美的曲线。


介绍了ZAP-70的3激酶滴定曲线(图3A + B)。

结果表明,使用用于许多TKS(Poly-GT或Poly-Gat)的FL Uoratece标记的基底允许使用Lanthascreen™格式开发“通用”TK测定。


结论

在BMG Labtech仪器上可以轻松测量Invitrogen的基于意识的Lythascreen™。德赢vwin官网客服测定显示了几个优点:

  • Lanthascreen™测定的比率性质消除了井变化。
  • 时间分离的性质允许使用FL Uoutcein,而无需复合干扰的相关缺点。
  • 使用FL Uoutcein Simpli Fi ES测定的能力的发展和成本。
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