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LanthaScreen TR-FRET酪氨酸激酶和蛋白激酶C测定

兰迪·霍夫曼(1)梅根·布洛斯(1)凯文·库普乔(1)EJ·戴尔(2) (1) Invitrogen (2) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH 12/2014
  • 使用专用光学设置的铽和荧光素双波长检测
  • 强烈和持久的供体信号使背景最小化
  • 快速可靠的检测PKC和酪氨酸激酶活性

表的内容

介绍

蛋白激酶C (PKC)酶是在特定信号条件下磷酸化丝氨酸和苏氨酸蛋白的多种酶。PKCs参与许多细胞功能,包括神经元活动、细胞生长、细胞增殖和细胞运动,以及心血管、癌症、糖尿病和阿尔茨海默病等几种疾病。因此,一个TR-FRET筛选试验,如这里描述的,可以帮助进一步阐明PKC的功能。


酪氨酸激酶(TKS)是各种各样的酶系列,其在氨基酸酪氨酸上磷酸化蛋白质的特定信号传导条件下。TKS涉及许多细胞功能,例如细胞分裂和细胞增殖,以及包括癌症和糖尿病在内的几种疾病。酪氨酸激酶在细胞生长中起重要作用,从而使其成为癌症治疗中的重要药物靶标。因此,如本文所述的Tr-FRET筛选测定,可以帮助阐明酪氨酸激酶的标本抑制剂。

测定原理

荧光素标记的poly-GT或poly-GAT (Glu, Ala, Tyr)底物与酪氨酸激酶和ATP孵育。在蛋白激酶C分析中,荧光素标记的PKC底物与PKC和ATP孵化液。随后,加入与底物磷酸化形式结合的铽标记抗体。当抗体与磷酸化的底物相互作用时,FRET将发生在铽标记物(发光在490 nm)和荧光素部分(发光在520 nm)之间(图1)。

测量是在490和520 nm和520/490的比例绘制与酶的浓度,以确定EC50用于酶及其基材。

材料与方法

  • Invitrogen公司的荧光素PKC底物和PKC激酶缓冲液(5x), PKCα,激酶猝灭缓冲液
  • Invitrogen公司的LanthaScreen™Tb-PKC底物抗体
  • Invitrogen公司的荧光素-poly- gt和荧光素-poly- gat,酪氨酸激酶缓冲液,ZAP70,筛选稀释缓冲液
  • Invitrogen的Lanthascreen®TB-PY20抗体
  • 黑色康宁®低体积384孔微孔板

PKC滴定
多种PKC亚型被滴定来确定筛选的最佳激酶浓度。下面的协议是用于确定EC的条件的示例50PKCα及其底物。一系列稀释PKCα,最终浓度为2.0µg/ml,在250 nM荧光素标记的PKC底物和20µM ATP(总体积为10µl)存在的微孔板中孵育。90分钟的孵化后在室温下,10µl TR-FRET稀释缓冲包含2 x EDTA(20毫米)和2 x Tb-PKC抗体(1.0 nM)和混合添加了创建一个最后的20µl /好吧,最后一个1 x EDTA的浓度10毫米,和最后一个1 x 0.5 nM的抗体浓度。室温孵育60分钟后,在BMG LABTECH微孔板阅读器上进行读数。德赢vwin官网客服每个数据点代表三口井的平均值。


酪氨酸激酶滴定
演示通用酪氨酸的功能激酶试验使用LanthaScreen™,两种荧光素-poly- gat (Glu, Ala, Tyr)和荧光素-poly- gt (Glu, Tyr)底物与铽标记的PY20抗体一起使用。


一系列稀释的激酶与400 nM荧光素标记的底物和200µM ATP(总体积为10µl)在微孔板中孵育。室温孵育60分钟后,加入含有4倍EDTA (60 mM)的tre - fret稀释缓冲液5µl。接下来,加入5µl的4倍抗体trf - fret稀释缓冲液(8 nM),混合至最终体积为20µl每孔,最终1倍EDTA浓度为15 mM,最终1倍抗体浓度为2 nM。室温孵育60分钟后,用酶标仪读板。

仪器的设置

Flyostar / Polartar Omega CLARIOstar PHERAstarFS.
检测模式 时间分辨荧光
方法 端点,顶级光学
光学设置 先进的扶轮基金会
光学头
Ex-Filter: TREx
EM-Filtera:EM520
EM-FILTERB:490-10
Ex-Filter: TR交货
EM-Filtera:520-10
EM-FILTERB:490-10
LanthaScreen
光模块:337 520 490
集成开始 100μs.
积分时间 200µ年代

结果与讨论

图2显示了PKCα和PKCζ的代表性激酶滴定曲线。

表1显示了所有激酶测试的统计数据。

表1:Pherastar上的Lanthascreen™:PKC同种型滴定的统计数据。

PKCα PKCß我 PKCß二世 PKCd PKCε PKCO PKCζ
EC.50(ng / ml) 0.43 0.27 0.22 0.07 0.03 0.16 0.12
最小值。 0.44 0.43 0.79 0.55 0.73 1.02 0.84
Max。价值 2.69 2.66 2.61 2.64 2.63 2.63 2.63
不等式性质 2.25 2.23 1.82 2.09 1.90 1.61 1.79
褶皱Diff(最大/最小) 6.1 6.2 3.3 4.8 3.6 2.6 3.1
小山斜坡 1.1 0.89 1.01 0.70 0.93 0.96 0.83
R.2 0.991. 0.996. 0.988 0.979 0.988 0.976 0.982
S: N 60 47 18 31 25 14 18
Z因子的值 0.94 0.91 0.78 0.87 0.85 0.74 0.79

所有PKC同工酶以与PKCα类似的方式滴定。无论“折叠差异”或信噪比比,所有测定都提供Z'值远远大于0.5。这是由于使用FRET的比例数据分析,这导致重复的低标准偏差。山坡和r2测量值在可接受的范围内。R.2接近1.0的值表示完美的曲线拟合。


图3为ZAP-70的激酶滴定曲线(图3A+B)。

结果表明,使用许多TKs常见的荧光素标记底物(poly-GT或poly-GAT)允许使用LanthaScreen™格式开发“通用”TK检测。


结论

Invitrogen公司基于铽的LanthaScreen™可以很容易地在BMG LABTECH仪器上进行测量。德赢vwin官网客服该试验显示了几个优点:

  • LanthaScreen™的比率特性消除了井间的差异。
  • 时间分辨的性质允许使用荧光素没有相关的缺点复合干扰。
  • 简化荧光素检测的发展和成本。
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