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龙沙PKLight蛋白激酶在PHERAstar FS读卡器上检测

Andrew Paine Lee Walker Cambrex生物科学(龙沙) 08/2005
  • 筛选1536种格式的所有蛋白激酶
  • 成本效益:不需要特殊抗体或放射性珠
  • 用Z'> 0.8简单且鲁棒的测定

表的内容

介绍

蛋白激酶及其磷酸化蛋白质的能力在许多疾病的信号转导途径中起关键作用,例如癌症,关节炎和糖尿病。蛋白质激酶的重要性使得它们在制药行业内许多高通量筛选(HTS)部门的常见目标。电流筛选技术采用磷酸化抗体或放射性珠粒。


龙沙开发了PKLightTM值,适用于96-,384-和1536孔格式中筛选潜在的所有蛋白激酶的非放射性,均匀,鲁棒和简单的测定。该技术利用荧光素酶生物发光来测量靶衬底的激酶磷酸化的ATP消耗。可以容易地针对每个激酶/衬底对进行优化测定,以产生适合IC的快速,质量数据50.筛选化合物的测定。


这种技术不需要抗体、放射性珠子、放射性标记ATP或特定修饰的底物序列。信号是半衰期大于2小时的发光,这是用一个发光仪检测到的,在我们的例子中是多功能的BMG实验室技术PHERAstar德赢vwin官网客服FS.板的读者。在本应用笔记中,我们使用Ser/Thr激酶,cAMP依赖蛋白激酶(PKA)来演示实验。

测定原理

在激酶反应期间,反应混合物中的游离ATP水平随着γ-磷酸转移到激酶底物中的γ-磷酸酯而降低。然后可以精确地测量自由ATP的下降。生物发光反应由萤火虫荧光素酶酶催化,并提供速度,敏感性和便利性。试剂含有荧光素和荧光素酶,其发射稳定的光信号,其强度与ATP的浓度成比例(图1)。


测定原理:添加到激酶反应期间消耗的反应混合物中加入的自由ATP的量可以使用来自LONZA的专利的生物发光荧光素酶激酶试剂精确测量。发射稳定的光信号,其具有与ATP浓度成比例的强度。随着激酶反应的进展,ATP浓度下降,发射的光变得更不强烈。

材料与方法

所有材料通过来自制造商的正态分布通道获得。

  • Lonza PKLightTM值套件
  • Pherastar.FS.,B德赢vwin官网客服MG Labtech,德国
  • 微孔板,白色384孔,Greiner,德国
  • ATP,BSA,Sigma UK
  • PKA, Kemptide, H-89二盐酸盐,Calbiochem®

lonza.激酶测定考察H-89二盐酸盐对cAMP依赖蛋白激酶(PKA)磷酸化Kemptide底物的抑制作用。酶、底物、ATP和H-89二盐酸盐稀释到工作浓度使用相同的PKA分析缓冲液,包括40 mM Tris-HCl (pH 7.5);20毫米MgCl2,纯化水0.1 mg/mL BSA。


ATP检测
在PKA测定缓冲液中稀释ATP,得到0-12.5μm的浓度范围,并加入到GRINER 384孔板中。加入ATP检测试剂并在Pherastar上的发光模式下使用1秒的集成时间后1分钟读取FS.


PKA活动/抑制
采用384孔白色板,每孔加5 μL PKA、5 μL Kemptide、5 μL ATP和5 μL抑制剂(H-89二盐酸盐)或PKA缓冲液。每孔总测定量为20 μL。反应混合物在室温下孵育20分钟。

通过将10μl的ATP检测试剂加入孔中并在室温下孵育10分钟来确定ATP的剩余量。在Pherastar上阅读了384孔板FS.在发光模式下使用1秒积分。


结果与讨论

的PKLightTM值如图2所示的蛋白激酶检测可以检测低水平的ATP,并具有特殊的线性(R2> 0.99)在Pherastar上使用的范围内FS.

如图3和4所示PKlightTM值测定可以准确地确定激酶活性和抑制,提供可靠的IC50.数据和干净的命中。

结论

使用cAMP依赖蛋白激酶(PKA)和Kemptide底物作为模型,我们已经证明了使用龙沙激酶试剂来测量激酶活性和抑制的有效性。


该方法非常简单地发展和运行,并且可能潜在地应用于任何ATP依赖性蛋白激酶和靶衬底。我们证明了Z'值大于0.8的稳健,足以确定低效力抑制。测定可以很容易地小型化到384孔板格式,潜力可以超越。

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