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寻找Physcomitrella Patens的强大推动者

Lucas Schneider(1)Manuel Hiss(1)Stefanie Tintelnot(2)Stefan Rensing(1) (1)马尔堡大学(2)BMG Labtech德赢vwin官网客服 11/2014
  • 用GFP和mCherry作为报告蛋白研究活原生质体96孔格式的启动子强度
  • 使用LVF单色仪,克拉罗星®可以检测每孔<100种原生质体

表的内容

总结

植物系统的广泛使用的35s启动子在苔藓中表达较弱Physcomitrella patens.。为了寻找更有效的启动子,分别用GFP和35s启动子控制的mCherry转染活苔藓原生质体。两者之比荧光强度信号用于确定试验促进剂强度。

本申请说明显示了在96孔微孔板格式中进行的测定。该www.v66088.com 微孔板读卡器检测到少量GFP(> 150)和MCHERRY(<100)转染的原生质体。此外,可以确定与35s促进剂相比的启动子的强度,并且促进剂Physcomitrella patens.被确定了。

与建立稳定的克隆相反,这需要转染后的膨胀和选择,瞬态转染提供了一种快速和经济的方法来比较推动者激活。

介绍

花椰菜花叶病毒35S启动子是一种强大的组成型启动子,广泛应用于植物系统中。然而,在苔藓中Physcomitrella patens.,它的启动子强度弱或全部,但在黑暗中沉默。因此,需要表达更高的表达水平的启动子,并且随时间,组织和治疗具有更普遍的表达。进一步的兴趣是可用于靶向基因表达的细胞或组织特定启动子。对于越来越多的处理可用的表达数据,可以基于这些数据选择合适的候选。


为了测试苔藓原生质体的启动子强度Physcomitrella patens.可以瞬时转染,以允许几天的圆形DNA的异位表达。该苔系统可用于测试启动子,而无需产生具有稳定集成的突变线。我们表明Clariostar可用于测量活苔原生质体内的GFP流动晶,并且该测定可用于比较推动者强度。为了使转化的正常化EF效率,将第二个报告者(MCHerry)引入系统中。

测定原理

可能的新启动子的验证通常由启动子报告者基因构建体进行。常用的系统用GFP融合了选择的启动子,然后测量将构建体插入植物后的流动水平。选择MCHERRY作为转染的报告者。GFP / MCHERRY比率将用于进一步的启动子强度分析。

质粒,携带促销区:: GFP或促进者:: GFP或Guiderc :: GFP构建作为第一个报告者以及推动者35s :: Mcherry构建体作为第二记者,瞬时转染到苔原原生质体中。对于MCHERRY构造,使用双35s启动子。报告信号在Clariostar微孔板读卡器中孵育六天后测量。GFP / MCHERRY-比率的统计分析允许测定启动子强度。


材料与方法

  • BMG Labtech Greiner的Clariostar Mic德赢vwin官网客服roplate Reader
  • Cellstar.®中等结合96孔半面积聚苯乙烯板,黑色透明散落在底部
  • 稳定且瞬时的GFP和MCHERRY转染原生质体Physcomitrella patens.在再生培养基中
  • 再生培养基含有以下物质:250 mg / l kh24.,250 mg / l kcl,250 mg / l mgso4.x 7 h.2O, 1000mg /L Ca(NO3.2x 4 h.2o,12.05 mg / l feso4.x 7 h.2O,50克/升葡萄糖和44克/兰甘露醇)

通过转染进行荧光强度测量Physcomitrella patens.原生质体。将100μl(高达30,000种原生质体)的样品体积置于黑色96孔微孔板中,透明底部。在波长优化之后,使用一个测试方案(EX / EM为GFP:480-12 / 519-15 nm来设置Clariostar的单色仪以测量GFP和MCHERRY FL荧光; MCHERRY:562-12 / 603-20nm)。使用具有2mm直径的底光学,轨道平均值和每孔15°灰2mm的轨道平均来检测样品。再生培养基用作坯料。所有启动子测量都是减去背景。计算GFP和MCHERRY信号的比率,以使转染的数据标准化为EF效率。


扫描井
随着Clariostar的扫描功能,可以检查井中原生质体的分布。使用20 x 20数据点的扫描矩阵设置仪器以从底部扫描。


结果与讨论

井扫描装置表明原生质体不会均匀地分布在井中(图2)。

由于这一发现,我们假设在一个小圆内的测量数据点更有用,然后对它们进行平均,而不是只在井中间进行测量。轨道平均功能在BMG LABTECH控制软件允许这样的测量,直径2毫米被发现德赢vwin官网客服给出最稳定的结果。


在确定最佳波长设置之后,确定单表达细胞系的原生质体稀释,以使每孔的最佳原生质体的最佳数量。图3显示了GFP和MCHERRY表达细胞的标准曲线。

Protoplasts稀释曲线均显示出每孔范围的广泛细胞上的良好线性。

图4和B比较野生型、GFP和mCherry表达原生质体样品的荧光强度值。在GFP的波长范围(480/519 nm)内,野生型和mCherry表达细胞系均存在一定的背景荧光(图4A)。在mCherry的波长范围(562/603 nm)中,野生型和GFP表达细胞株几乎没有背景信号(图4B)。在低至150个表达GFP的原生质体和应答蛋白中均可检测到显著信号。mCherry原生质体表达量< 100 /孔。


推动者强度分析
在启动子强度分析中,每孔使用4000个稳定表达GFP和mCherry的原生质体。图5显示了不同启动子::gfp结构的结果。

利用GFP/mCherry比率来评估不同启动子的转染实验。从图5可以看出,启动子B是测试最强的启动子。


结论

我们使用BMG Labtech的Clariostar引入瞬态测定,可用于测德赢vwin官网客服量在微孔板格式中的活生质网盒中的GFP和MCHERRY FLOorescescess。对于这样的测定,可以在瞬时转染的细胞中进行表达研究。与使用抗生素后转染选择的耗时过程相比,这是一个非常快速简单的方法。在未来,该测定形式可用作筛选瞬时转染的原生质体的标准方法。

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