242

低体积蛋白测量(280nm):在多种浓度下验证LVis平板

Sarfaraj Topia Alison Turner UCB制药 07/2013
  • 用不同的仪器测量紫外蛋白在280 nm处的吸光度
  • 用来自BMG LABTECH的酶标仪上的LVis板成功地在2µl中测量了低范围和高范围的蛋白浓度德赢vwin官网客服

表的内容

介绍

以高通量的方式测量实验的工作浓度是有用的,特别是当蛋白质的稀释可能影响溶解特性时。当需要对大量样品进行精确的蛋白质浓度时(例如,柱洗脱馏分),这也将是有利的,稀释将耗费时间,并可能引入移液误差。当样品数量有限时,再加上能够以小容量分析样品的能力,也将提供额外的优势。


LVis平板是BMG实验室专有的吸光度微孔板,非常适合于低体积的蛋白质定量。德赢vwin官网客服它由16个微滴孔组成,每个孔为2 μL,符合96孔板格式定义。微滴井的井位也很容易进行擦拭,以便进行进一步的测量。

目的是证明LVis平板能够在两个不同的浓度范围(0.2至18 mg/mL)下可靠地测量蛋白质浓度,与其他方法、紫外/可见分光光度计(手动试管取样)和高通量技术(NanoDrop)相比。


LVis平板与microplate reader (BMG LABTECH)一起使用,micropl德赢vwin官网客服ate reader有一个超快紫外/可见光谱仪。该技术在<1秒/井内捕获整个光谱(220 - 1000nm)。LVis板与分光星兼容®纳米,欧米茄系列,pherstar®FS, CLARIOstar®microplate读卡器来自BMG LABTE德赢vwin官网客服CH。

材料与方法

  • 样品蛋白原液30mg /mL,加入20 mM醋酸钠,100 mM氯化钠,pH 5.0
  • 工作缓冲液:50 mM醋酸钠,100 mM氯化钠,pH 5.0[过滤(0.22μm)]
  • LVis板材(BMG LA德赢vwin官网客服BTECH)
  • Cary Bio 50,紫外/可见分光光度计
  • 英国Thermo Scientific公司的NanoDrop

实验1
比较低浓度范围(最高为1 mg/mL)的重现性。样品蛋白为全长单克隆抗体。


在缓冲液中连续稀释蛋白原液,范围从0.2 mg/mL到1.0 mg/mL(详细见上文)。用LVis平板(BMG LABTECH)测量280 nm处的吸光度,并与其他分光光度计、紫外/可见分光光度计和纳米液滴的德赢vwin官网客服结果进行比较。每种方法测量一式三份。


LVis板和纳米滴分别为2 μL,紫外/可见分光光度计为100 μL。在每一种情况下,样品都在缓冲区上空白(详细的上面)。
推导出每种方法在每种浓度下在280nm处的吸光度读数的平均值和标准偏差,然后绘制出标称浓度(图1 - 4)。


实验2
在较高的浓度范围内(最高18 mg/mL)比较重复性。


本实验只比较了LVis板和NanoDrop,因为已知UV/Vis分光光度计在较高的浓度范围内的线性是不可靠的,因此不能提供一个公平的测试。在缓冲液中从18mg /mL稀释到1mg /mL蛋白(详见上文)。进行了三次测量,并绘制了实验1中的数据(图5)。

结果与讨论

实验1
在0.2 mg/mL和1.0 mg/mL浓度范围内,绘制280nm处的平均吸光度(OD)与浓度的关系,并进行线性回归拟合。


一个高的R平方值(R2)在紫外/可见分光光度计(图1)、LVis平板(图2)和纳米液滴(图3)中获得超过0.99。


从每种测量技术获得的数据叠加(图4)显示,三种方法之间存在良好的相关性。

实验2

本实验的目的是为了验证LVis平板在较高浓度(高达18 mg/mL)下与纳米液滴相比的吸光度测量的可靠性。将不同浓度下的平均吸光度值与反计算的浓度绘制成线性关系。


R的平方(R2)对于LVis平板和纳米滴来说都超过0.99,两种方法之间可以观察到良好的相关性,如图5所示。

结论

所有三种测量浓度达1毫克/毫升的仪器显示了相同的结果。在浓度高达18 mg/mL时,LVis平板和纳米液滴(一种替代的高通量方法)显示了可比的结果。总之,LVis平板被证明是一种可靠的、低体积、高通量的方法,用于测定0.2 mg/mL至18 mg/mL的蛋白质浓度。这在现有的替代分光光度法技术中得到了验证。

去前