292

荧光测定使用ClarioStar监测赖氨酸脱乙酰酶活性

M. Rajaee T. Ekblad H.Schüler Karolinska Institutettet Stockholm. 02/2016
  • CLARIOstar mono色谱仪的功能可以方便地适应商业检测试剂盒的成分,并进一步优化检测参数
  • 动力学参数K.m, kcat和V最大和集成电路50Sirtuin酶抑制剂的价值计算

表的内容

介绍

蛋白质乙酰化是蛋白质活性的普遍调节机制。表观遗传药物发现的最新发展导致对研究赖氨酸脱乙酰化的方法的兴趣增加,包括体外赖氨酸脱乙酰酶的测定。1在这里,我们优化了一种商业肽酶偶联赖氨酸脱氨酸脱乙酰酶测定以建立酶促性能大肠杆菌Cobb。COBB是一种参与细菌转录,翻译,代谢和趋化性的Sirtuin型酶。2-4

测定原理

Cyclx Sirt1测定试剂盒利用与F1 uorophore及其猝灭剂缀合的乙酰化肽(面板1)。肽(面板2)内赖氨酸残基的酶促脱乙酰化产生功能肽酶切割位点。肽酶通过肽酶从猝灭剂分离脱乙酰化肽的快速随后切割,并允许反应(面板3)的荧光读出。


材料与方法

  • 384孔黑色平底微孔板(Greiner, #781900)
  • SIRT1荧光检测试剂盒(CycLex, CY-1151V2)重组大肠杆菌Cobb.
  • www.v66088.com 来自BMG Labtech的微孔板读卡器德赢vwin官网客服

通过正态分布通道获得所有标准化学品和一次性产品。his6标记大肠杆菌CobB表达在大肠杆菌用pET28表达载体转染BL21(DE3)细胞,并使用包括固定化金属离子层析(HisTrap, GE Healthcare)和尺寸排除层析(Superdex-75, GE Healthcare)的标准方案进行纯化。CobB赖氨酸去乙酰化酶活性在环境温度(21°C)下测量,一般条件在制造商方案中描述,修改如下。酶学检测采用50 nM CobB,加入NAD+抑制剂如所示。

仪器设置

检测模式: 荧光强度
检测方法: 板模式动能
循环数量: 120
周期时间(秒): 60
不。闪光: 5.
扫描模式: 平均轨道
扫描直径(mm): 1
励磁: 355 - 10
二向色性: 400 (autoset)
排放: 445 - 10
摇晃: 每个周期前8秒
摇动模式: 轨道,400 rpm

结果与讨论

在具有测定试剂盒中提供的Fl uoorogenc肽的激发和发射参数的优化表明,可以提高激发和发射设置。我们使用ClarioStar单色器在355/10nm的激发中,二色性设定为400nm,并在445/10 nm处发射。这导致了最高的信号,虽然它没有改变Z'因子5.使用上述设置或提供者推荐的设置,该值为0.78。

动力测量的参考曲线
稀释系列去乙酰化参考肽与检测试剂盒提供用于校准测量(未显示)。

CobB赖氨酸去乙酰化酶活性的基本动力学参数

我们在各种浓度的NAD存在下进行COBB酶测定+和荧光底物肽在SIRT1检测试剂盒手册推荐的浓度。在我们的实验条件下,我们确定了Kmnad +我们不知道NAD已公布的动力学参数+通过柯布乳沟。

用一般的sirtuin抑制剂抑制CobB
Ex527是一种一般的sirtuins抑制剂。6.我们确定了EX527抑制COBB活性的效力。使用70μmnad进行测定+作为共底物,改变Ex527浓度,最终DMSO浓度为1%。分析结果如图4所示。

EX527是一种弱COBB抑制因素(IC50515μM;Ki = 259 μM(用Cheng-Prusoff方程测定)。抑制剂的效力低,加上其有限的溶解度和酶的DMSO敏感性,影响了测定的质量;Ex527浓度高于1 mM的影响无法在1% DMSO下测量。

结论

我们使用了ClarioStar多模微孔板读者来确定动力学性质大肠杆菌赖氨酸去乙酰化酶CobB及其一般sirtuin抑制剂的抑制,使用商业检测试剂盒。我们的结果说明了一般的方法,这对于其他赖氨酸去乙酰酶的类似研究和原则上的赖氨酸导向乙酰转移酶的研究都是有用的。


致谢

COBB表达载体由Dmitry Ivanov(新加坡分子和细胞生物学研究所)友好提供。这项工作得到了瑞典战略研究,德赢Vwin安全吗Ingabritt和Arne Lundbergs研究基金会和Karolinska Institutet的支持。


参考文献

Huston等。(2015)NAT。化学。医学杂志。11,542-545。
2.Baeza等(2014)J. Biol。289年化学,21326 - 21338。
3.tao等(2010)PLoS One.5(12), e15123。
李等人。(2010)mol。微生物。(76),1162-1174。
5.Zhang et al. (1999) J. Biomol。屏幕上。(4), 67 - 73。
6.Ekblad & Schüler(2016)化学。医学杂志。药物第87,478-482条。

去前