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用CLARIOstar荧光法监测赖氨酸脱乙酰酶活性

M. Rajaee T. Ekblad H.Schüler Karolinska Institutettet Stockholm. 02/2016
  • ClarioStar单色仪功能可方便地适应商业测定试剂盒组分以及进一步优化测定参数
  • 动力学参数K.m,kcat和v马克斯和IC.50.Sirtuin酶抑制剂的价值计算

介绍

蛋白质乙酰化是一种普遍的蛋白质活性调节机制。近年来,表观遗传药物的发现引起了人们对赖氨酸脱乙酰化研究方法的兴趣体外赖氨酸脱乙酰酶的测定。1在此,我们优化了一个商业肽酶偶联赖氨酸去乙酰化酶的测定,以建立酶的性质大肠杆菌科布。CobB是一种sirtuin型酶,参与细菌转录、翻译、代谢和趋化的调控。2 - 4

测定原则

CycLex SIRT1检测试剂盒利用一个乙酰化的肽结合到一个荧光团和它的猝灭剂上(图1)。肽内赖氨酸的酶解去乙酰化(图2)生成一个功能性肽酶裂解位点。随后由肽酶快速切割去乙酰化肽,从猝灭器中分离出荧光团,并允许荧光读出反应(图3)。


材料与方法

  • 384-井黑色底部微孔板(Greiner,#781900)
  • SIRT1 fl uorimetric测定试剂盒(Cyclx,Cy-1151v2)重组大肠杆菌科布
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所有标准化学品和一次性用品都是通过正常的销售渠道获得的。His6-taggedE.coli.CobB表示为E.coli.用PET28表达载体转染的BL21(DE3)细胞,并使用涉及固定的金属离子色谱(HISTRAP,GE Healthcare)和尺寸排阻色谱(SuperDex-75,GE Healthcare)的标准方案进行纯度。COBB赖氨酸脱乙酰酶活性在制造商方案中描述的一般条件下在环境温度(21°C)下测量,如下所述的修正阳离子。使用50nm cobb进行酶测定,添加NAD+和抑制剂如图所示。

仪器设置

检测模式: 荧光强度
检测方法: 板模式动力学
循环数量: 120.
循环时间(秒): 60.
不。闪光: 5.
扫描模式: 轨道平均
扫描直径(mm): 1
励磁: 355-10
二向西: 400(自动核集团)
排放: 445-10
震动: 每个周期之前8秒
摇动模式: 轨道,400 rpm

成绩与讨论

荧光肽检测试剂盒提供的荧光肽的光谱扫描图(图2)表明,荧光肽的激发和发射设置可以得到改进。我们使用CLARIOstar单色仪,激发波长为355/10 nm,二向色波长为400 nm,发射波长为445/10 nm。这导致了最高的信号,虽然它没有改变Z '因子5.使用上述设置或提供者推荐的设置为0.78。

动力学测量的参考曲线
用测定试剂盒提供的脱乙酰化的参考肽的稀释系列用于校准测量(未示出)。

COBB赖氨酸脱乙酰酶活性的基本动力学参数

我们在不同浓度的NAD存在下进行CobB酶分析+在SIRT1测定试剂盒手册中推荐的浓度下的流量源性底物肽。在我们的实验条件下,我们确定了一个kmNAD +71μm(图3)。我们不了解NAD的发布动力学参数+Cobb裂解。

通过一般的Sirtuin抑制剂抑制COBB
EX527是SIRTUIN的一般抑制剂。6.我们确定了EX527抑制COBB活性的效力。使用70μmnad进行测定+作为共衬底和外射浓度的ex527,具有1%的浓度为1%的ex527。该分析的结果如图4所示。4。

EX527是一种弱COBB抑制因素(IC50.515μm;ki =259μm使用Cheng-Prusoff方程测定)。抑制剂的低效力,与其有限的溶解度和酶的DMSO敏感性组合,损害了测定的质量;ex527浓度高于1mm的效果不能在1%DMSO下测量。

结论

我们使用CLARIOstar多模式酶标仪测定了其动力学性质E.coli.使用商业测定试剂盒,赖氨酸脱乙酰酶COBB及其抑制作用的一般Sirtuin抑制剂。我们的结果说明了一般方法,其应有助于与其他赖氨酸脱乙酰酶类似的研究,原则上是赖氨酸指向乙酰转移酶。


致谢

CobB表达载体由Dmitry Ivanov(新加坡A-Star分子与细胞生物学研究所)提供。这项工作得到了瑞典战略研究基德赢Vwin安全吗金会、IngaBritt和Arne lundberg研究基金会和Karolinska研究所的支持。


参考

Huston等。(2015)NAT。化学。BIOL。11,542-545。
2. Baeza等。(2014)J. Biol。化学。289,21326-21338。
3. Thao等。(2010)PLOS一项,e15123。
4.Li等(2010)Mol. Microbiol。(76), 1162 - 1174。
5.张等人。(1999)J. Biomol。屏幕。(4),67-73。
6. Ekblad&Schüler(2016)Chem。BIOL。药物des。87,478-482。

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