在CLARIOstar Plus上测量红色荧光染料以提高多路复用能力，并进行细胞分析

CLARIOstar+在测量红色荧光染料时提供最高的灵敏度
alex氟的检出限测定^®647: 0.8点
改进的HTRF测量由于专用探测器

表的内容

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介绍

基于荧光的检测方法由于许多优点而征服了生命科学实验室的工作台:荧光团通常是无毒的，他们是负担得起的，可以多次测量。它们的强度与它们的浓度呈线性关系，最后但并非最不重要的是，可用的检测方法的数量是巨大的。不仅荧光分析法本身的使用增加了，特别是红色和红外波段染料的使用也增加了。

是什么促使人们转向红色染料?
多路复用。研究发展迅速，因此需要在短时间内获得大量准确的数据。因此，多个测定并行运行，允许在一个样品中检测多个生物方面。例如，荧光报告蛋白的表达可以参考细胞活力。然而，在同一样品中测量的荧光团和荧光团需要进行光谱分离，以实现有效的信号分离。许多传统的分析方法是基于染料在绿色范围内的排放(AlexaFluor^®488年,FITC GFP)。荧光染料与这样的分析相结合时，经常会发生红移。同样，红色荧光染料也需要多路发光。如图1所示，荧光酶发出的光波长范围很宽，通常可达500-600 nm。只有当它与发光波长超过650 nm的红色荧光团结合时，才有可能分离发光和荧光信号。

荧光素酶的发射光谱 — 图1:荧光酶的发射光谱。对于多路复用，它们只能与红移荧光团(发射波长> 650 nm)结合。

细胞和复合物样品的自发荧光减少。在复杂的生物样品中，有许多不需要的荧光成分干扰感兴趣的荧光团信号(自荧光):芳香氨基酸侧链、NAD(P)H、黄素或苯酚红占据紫外光谱到红色范围。这些分子主要存在于细胞或复杂的样品中，如血清和血浆。

使用荧光团发射进一步在红色范围(>650 nm)防止获得自动荧光。另一种方法通过两种方式绕过自动荧光:当自动荧光已经褪色时，检测到长寿命的荧光团，并将其检测为红色。这一原理在通过FRET测量分子相互作用的均匀分析格式中很流行:均质时间分辨Förster共振能量转移(HTRF)^®Cisbio)。寿命较长的荧光团被用作供体，只有在接近的情况下，才能将能量转移到红色受体荧光团。

使用红色荧光染料是不可避免的，当测量细胞或多次测定一次。因此，我们测试了克拉罗星的性能+用专门的探测器测量红色alex氟化物^®647，并比较了用标准和专用探测器(PMT)进行的HTRF测量。

材料与方法

AlexaFluor 647测试
测试克拉罗星+是用AlexaFLuor进行的吗^®647，一个明亮的荧光团，在640 nm左右被激发，并在680 nm处发出(图2)。

黑色384sv孔板(Greiner #784076)
CLARIOstar+(德赢vwin官网客服BMG LABTECH)
AlexaFluor 647 (ThermoFisher Scientific)
PBS (Biochrom # L1825)

荧光团稀释至标准品100 nM;20 nM;4海里;0.8 nM和0.16 nM PBS。将8个重复(20µl)和85个PBS空白(20µl)移液到极板中测定检出限。在克拉罗星上测量荧光+使用以下仪器设置。

仪器的设置

光学设置	荧光强度，顶部光，终点
	探测器	专用的红移PMT
	过滤器	例:640 - 10 二向色性:LP664 新兴市场:680 - 10
	获得	功能
一般设置	数量的闪光	One hundred.
一般设置	沉淀时间	0.1秒

HTRF测量的检测器比较
为了比较HTRF测量中的标准和专用检测器，使用了基于Eu Cryptate供体(发射620nm)和XL665(发射665nm)受体的Cisbio试剂盒。

白色96孔半面积微孔板(Cisbio提供)
CLARIOstar+(德赢vwin官网客服BMG LABTECH)

仪器的设置

光学设置	时间分辨荧光，双色度
	探测器	专用红移PMT和标准PMT
	过滤器	前女友前TR。二向色性:LP TR Em 1: 665 - 10, Em 2: 620 - 10
	集成时间	60µ秒，时间:400µ秒
一般设置	数量的闪光	200
一般设置	沉淀时间	0.1秒

结果与讨论

测定了亚力克氟647的标准曲线，以确定其在克拉罗星上的检出限+(图3)。从100 nM下降到0.16 nM的标准曲线与> 0,9999的R²高度线性相关。按照IUPAC标准计算检出限为0.8 pM(表1)。

表1。在克拉罗星上测得的AlexaFluor647的探测极限计算+

空白标准差(及%CV)	19.6 (2.2%)
线性回归斜率	76676
检测限- LOD (3* SD_BI/坡)	下午0.8点

高灵敏度不仅限于红色染料。FITC的LOD为0.15 pM(数据未显示)表明，专用PMT是红色和绿色荧光团的多路检测的合适解决方案。

测试专用的红移探测的克拉罗星+因为HTRF的测量显示了分析窗口的改进，测量的稳定性和结果的分析质量。deltaF是一种测定窗的量度，它关系到阳性对照和阴性对照的FRET比率的增加。与标准检测仪相比，使用专用检测仪大大提高了该测量值(图4)高阳性对照+17%，低阳性对照+ 15%。此外，空白的%CV(信号稳定性的衡量指标)被专用检测器降低，整个检测质量得到了提高。Z '值表示检测质量，包括信号稳定性以及阳性和阴性对照之间的距离。低信号的HTRF检测极大地受益于新型检测器，因为Z '从0.27提高到0.66(143%)。高信号的HTRF检测显示非常高质量的Z’> 0.9，而不考虑检测器(图4)。