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通过实时监测细胞外酸化和氧气消耗来测量细胞代谢的变化

David Hoffman(1)Carl Peters(2) (1)Cayman Chemical Ann Arbor,MI(2)BMG 德赢vwin官网客服Labtech Inc.NC USA 05/2017
  • Clariostar.®具有大气控制单元(ACU)提供了开放式呼吸测定系统中的关键元件
  • OCR和ECA在生理相关的大气条件下实时测量同时测量

表的内容

介绍

细胞能量代谢的失调是各种疾病的常见因素,包括糖尿病和肥胖以及名称少数癌症。用于评估通过细胞外acidi(ECA)和氧气消耗率(OCR)进行线粒体功能的目前的技术通常以这样的方式设计,使得它们忽略O的影响2集中于细胞生物能学。


在这里,我们描述了与ACU的Clariostar的实现与晚期磷光染料一起测量o2开放式呼吸系统系统中的消耗和糖酵解FL UX。该系统可以在稳定状态下测量呼吸率,其中o2提供等于O.2消耗。磷光氧和pH探针(开曼化学公司)与CLARIOstar和ACU相结合,提供了一个“按钮”多路复用系统,具有监测额外细胞健康结果的潜力。实验可以在用户定义的[O2],使用粘附细胞或细胞悬浮液,其中相关的吞吐量与现有技术相当。


测定原理

开放流量呼吸测量法是一种有用的,生理学相关的方法,允许在动态稳定氧浓度下测量线粒体呼吸速率1,2。为了提高吞吐量,该系统被翻译成96孔板格式。这需要使用至少2个具有零呼吸的阴性对照孔(图1)。实验样品的结果从对照中减去以计算呼吸速率。

材料与方法

  • 磷光氧气和pH探针(Cayman Chemical)
  • Clariostar与Acu(BMG La德赢vwin官网客服btech)
  • 黑色,透明底,96孔板(Greiner) H9C2细胞和HepG2细胞
  • 来自市售来源的其他试剂

所指示的细胞类型以7×10的密度镀4.细胞/孔。如套件文献中所示,试剂制剂,细胞播种,仪器设置,和测定方案都进行了。


在剂量反应实验中,在DMSO中制备一系列稀释的抗霉素A,形成10点半对数稀释系列,最大浓度为10 μM(最终DMSO浓度为0.01%)。


Clariostar测试协议还提供了测量设置,可用在这里


测试方案包括使用船上试剂注射器来添加对照化合物。寡霉素用于降低OCR并增加ECA。FCCP用于增加OCR。这些对照化合物包括在试剂盒中。


仪器设置

mitoxpress®XTra. ph-xtra.TM值
视镜设置 时间分辨荧光,顶部光学
激励:ex tr
二向色:LP TR
排放:645 - 20 排放:615-18
多元族(4)
集成设置
集成窗口1
开始:30μs,时间:30μs 开始:100μs,时间:100μs
集成窗口2.
开始:70μs,时间:30μs 开始:300μs,时间:100μs
通用设置 安定时间:0.2秒
每孔闪光次数:100
动态设置 循环次数:60
循环时间:280秒
大气控制 温度:37°C
氧气:10%
注射 体积:5μL,泵速:430μl/ s
1(低聚霉素):注射循环20
2 (FCCP):注射周期40


在MARS,BMG Labtech的数据分析软件中进行了ECA和OCR的计算。德赢vwin官网客服数据分析模板可在上面指示的Web地址中获得。在火星中也进行了对剂量反应和Z'数据的后续分析。


结果与讨论

当磷光氧气和pH探针与ACU的Clariostar一起使用时,可以观察到ECA和OCR的实时变化(图2)。在初始20分钟的平衡之后,可以观察到OCR的稳态信号。在其注射后,还观察到响应于对照化合物的OCR和ECA的预期变化。

作为该试验的化合物筛选对已知的线粒体抑制剂A抗霉素A的剂量反应的实例。图3显示了anitmycin a对OCR的预期浓度依赖性作用。从这个剧情IC50.确定120.8nm。可以获得类似的结果对ECA分析(数据未显示)。

最后,我们计算了该测定的Z'统计(图4)。值高于0.59表示优异的测定,其非常适合筛选目的。

结论

磷光氧气和pH探针(Cayman Chemical)和ACU的Clariostar提供了一种测量细胞生物共生学的稳健和效果,可以在[o2与生理相关的。通过使用非粘附细胞和执行额外的多路操作来检测额外的细胞反应,还可以获得额外的效用。


参考文献

1. COLE R.P.等人(1982)在肌球板J.PASP存在下的线粒体功能。physiol。53,1116-1124
2.霍夫曼,D.L.ET AL(2007)对稳态氧气张力产生的线粒体反应性氧物种的respsonse:对缺氧细胞信号的影响。J.心脏。CIRC。physiol。292,H101-108

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