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测量三维细胞培养中的线粒体功能和糖酵解通量

Conn Carey James Hynes 豪华莱科斯 09/2014
  • 3d木筏TM值在96孔微孔板格式中使用细胞培养物
  • 尿映射XTRA氧气消耗测定(HS方法)和pH-XTRA
  • 糖酵解测定用于确定线粒体函数和糖酵解FL UX

表的内容

介绍

虽然,历史上,2D文化一直是体外测定的主要效果,但在努力中转移到3D模型存在发展的兴趣,以提高测量的生物学相关性。通过在组织内更紧密地进行繁殖的条件,希望如此3D模型将有助于弥合之间的差距在体外体内从而增加了在体外化验。与增加生物学相关性的目标同等重要的是测量的参数。其中最有意义的是测量细胞代谢,从而在不破坏三维结构的情况下探测紊乱的代谢或线粒体功能。这可以用微滴定板格式来实现Mitoxpress XTra HS.ph-xtra.Agilent Technologies的产品。


Mitoxpress XTra HS.测量氧气消耗,因此在线粒体功能上通知特定的情况ph-xtra.因此,测量细胞外acidi阳离子,因此是一种方便的糖酵解流体含量。在这里,我们展示了这些探针技术在使用的3D培养物中的应用™系统从TAP Biosystems。™促进方便地生产一致的胶原基结构。这将结合起来Mitoxpress XTra HS.ph-xtra.促进详细的基于微孔板的3D培养代谢活性测量,而不破坏3D结构的完整性。测量是在BMG实验室技术公司的氟星Omega微孔板读卡器上进行的。德赢vwin官网客服

材料与方法

  • 3dTM值培养物,包括黑墙透明底部96孔细胞培养微孔板,乳斑块Xtra-氧消耗测定[HS方法],(安捷伦技术,MX-200-4)
  • ph-xtra.糖酵解分析,(安捷伦技术,PH-200-4)
  • flyostar.®Omega microplate reader (德赢vwin官网客服BMG LABTECH)
  • DMEM和培养基均通过常规分销渠道获得

板材准备
3D用A549或HEPG2细胞(数据未示出)在96孔板上以240μLDMEM/胶原溶液中的指示密度进行制备3D筏培养物。根据制造商的协议形成筏培养物(图1)。

(图1A)将细胞与中和的胶原蛋白混合并移液至同一孔中。37℃孵育15分钟后形成水凝胶。从水凝胶中吸收培养基(图1B),以增加胶原蛋白浓度和细胞体内条件。该过程在不到1小时内完成(图1C),并产生了大约120 μm厚的结构。


耗氧量测量
培养一段时间后,除去培养基,加入100 μl预加热的DMEM配制的MitoXpress Xtra原液。在相应孔中加入100x的化合物1 μl。加入100 μl预温的HS矿物油封闭所有孔,防止环境氧的反扩散。然后在fluosstar Omega上在37°C下动态测量板90-120分钟。


细胞外acidi阳离子测量
测量前两小时筏细胞培养板置于CO2在37°C, 95%湿度下自由培养箱,以去除CO2从印版材料。除去培养基,使用呼吸缓冲液(0.5 mM KH)进行2个洗涤步骤24.,0.5 mm k2HPO.4.,20mm葡萄糖,4.5g / L NaCl,4.0g / L KCl,0.097 g / L mgso4.,0.265 g / l cacl2)。最后150μl含有pH-XTRA的呼吸缓冲液TM值向每个孔中加入推荐浓度的探针。然后在动力学上测量板。

Fluostar Omega / Clariostar®仪器设置

测量方法: 时间分辨荧光(安装了ω:TR-F光学附件)
测量模式: 板模式动力学
测量时间: 120分钟(每2分钟数据点)
测量的温度: 37℃

使用以下窗口进行双重着色:

激发/发射过滤器 集成启动/时间(µ年代)
mitoxpress.®字母x

1 Trex L + 655-50(Omega)+ 645-20(Clariostar)

2 TREX L + 655-50(OMEGA)+ 645-20(克拉克罗斯塔尔)

30/30

70/30

ph-xtra.TM值糖酵解过程分析

1 TREX L和615-BP10 100/40

2 TREX L和615-BP10

100/40

300/40

结果与讨论

图2给出了样品耗氧量的剖面图。

增加3D矩阵中的细胞的密度导致氧气消耗的速率提高,并且在测试的细胞浓度上观察到强的信号变化。图3显示了在等等活性的3D结构内的细胞对细胞的影响。样品酸纤维粘合剂在图4中介绍,具有针对未处理的细胞观察到的酸性阳性。

几乎完全抑制了酸杂化物的治疗,表明酸纤溶来自乳酸的产生。然而,用抗霉素治疗acti酰胺酰胺的显着增加,细胞增加糖酵解fl ux以维持细胞ATP供应。


结论

MitoXpress超耗氧分析和pH-Xtra糖酵解分析,提供了一个方便,敏感和高通量的测量线粒体功能,代谢和细胞能量通量,当结合氟星Omega多模式平板阅读器。这些数据说明了这些分析方法在复杂的多细胞三维筏中研究细胞功能的适用性TM值没有破坏文化系统的完整性的三维结构。fluosstar Omega具有菜单选择功能,便于仪器设置和数据分析,包括输入校准以生成O2和H.+鳞片。

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