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用荧光Omega微孔板阅读器测量线粒体膜电位

希瑟·莫提博斯,奥利弗·班德曼 谢菲尔德学术神经病学 07/2008
  • 用烧血细胞测量的线粒体膜电位
  • 四甲基溴胺甲基酯流荧光直接与膜电位成比例
  • 在BMG Labtech的德赢vwin官网客服Fluostar上进行®欧米茄96和384孔板格式

表的内容

介绍

线粒体膜势的测量可用于各种研究区域,线粒体功能障碍涉及癌症,糖尿病,帕金森病和中风等疾病。德赢国际是真是假


在大多数真核细胞中,大多数ATP生产是通过呼吸链氧化磷酸化。以这种方式,糖类如葡萄糖和游离脂肪酸被氧化,导致在内部线粒体膜上泵送质子,产生电化学梯度(线粒体膜电位)。这反过来由呼吸链的复杂v用于产生ATP。因此,线粒体膜电位构成细胞的生物能量状态的大部分,并且根据细胞能量需求直接改变。例如,快速生长的肿瘤细胞具有比WT细胞更高的线粒体膜电位,并且静止静脉或分化细胞具有仍然较低的膜电位。


精确测量线粒体膜电位的能力可以提供关于线粒体的一般健康和功能的宝贵信息,特别是呼吸链的整体功能和线粒体产生ATP和为其他细胞成分提供能量的潜力。

影响这一潜力的因素很多,包括线粒体之外的许多细胞成分,例如与蛋白酶体活性的相互作用。此外,细胞维持线粒体膜电位的能力可能意味着细胞存活、进入凋亡细胞死亡或坏死细胞死亡过程之间的区别。完整的线粒体膜电位也是细胞进入凋亡的必要条件。线粒体膜电位通常用无创阳离子染料测量。这些染料被隔离到线粒体基质中,其数量与膜电位成正比,然后可以使用标准荧光技术进行测量,包括荧光显微镜、流式细胞术或使用用于高通量分析的微孔板阅读器。


德赢vwin官网客服BMG实验室的氟星Omega微孔板读卡器用于高通量筛选试验,测量人类细胞线粒体膜电位。本文所介绍的结果是使用对照组的原代人成纤维细胞获得的。

材料与方法

  • 从Coriell Cell储存库获得的人体烧血细胞
  • 黑色96或384孔板,来自Greiner的透明底部
  • 四甲基罗丹明甲酯(TMRM)
  • 羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP),Sigma
  • 乙锭同型二聚体荧光染料,Invitrogen
  • 星欧米茄微孔板读卡器,BMG实验室德赢vwin官网客服

成纤维细胞在96孔或384孔板中以40%的合流度被放置在含有10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、1 mM丙酮酸钠、2 mM l -谷氨酰胺、0.1 mM氨基酸、50 μg/mL尿苷和1 X MEM维生素的最小生长培养基MEM中。


24小时后将细胞转化为半乳糖培养基MEM(不含葡萄糖),如上所述添加10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和0.9 mg/mL半乳糖。


在进一步24小时后,使用如前所述的Fl荧光染料四甲基吡喃胺甲酯(TMRM)测量线粒体膜电位。将Brie Fl y染料在50nm的测定缓冲液(80mM NaCl,75mM KCl,25mM D-葡萄糖,25mM HEPES,pH 7.4)中加载到细胞上,置于37℃的5分钟后,在PBS中洗涤4次并在FlyoStarω微孔板读卡器上测量(激发:544nm和发射:590nm,底部读数,每孔50°Fl)。


最初通过质膜将TMRM加载到电池中,随后将TMRM染料螯合到线粒体中,因为线粒体基质是细胞的最负荷部分。因此,血浆膜电位的变化可以在使用TMRM获得的结果中的影响。为了控制这一点,每个测定与上面并联进行加上10μm羰基氰化物3-氯苯基腙(CCCP),其塌陷线粒体膜电位。所有数据表达为总TMRM FOR荧光减去CCCP处理的TMRM FOR荧光。

定量和控制细胞数量是很重要的,特别是在比较细胞系之间的结果时,因此在冷冻解冻后,使用1 μM乙锭同型二聚体荧光染料在平行板中测量细胞数量(激发:544 nm,发射:645 nm,底部读数50次闪烁每孔)。

结果与讨论

图1显示了在6个控制烧结细胞系中的线粒体膜电位,每次在单独的场合以三份测量并显示控制细胞系之间的变化缺乏变化。

图2显示了同样的对照成纤维细胞在用线粒体毒素“X”治疗72小时后膜电位的下降。这表明了检测的敏感范围,创造了一个大的“治疗窗口”。同样在这张图中,对照细胞已经被处理了实验性化合物“Y”,它挽救了由处理线粒体毒素“X”引起的线粒体膜电位的降低。

图3显示,该检测方法可以可靠地扩展到384孔板格式,并获得可靠的、可重复的结果。

结论

这些结果表明,fluorstar Omega适用于96孔板和384孔板的线粒体膜电位测量。此外,用线粒体毒素长期低剂量治疗健康对照成纤维细胞可导致线粒体膜电位显著降低。


结果在许多不同的控制烧血线上可再现,并且使用实验化合物的这种缺陷的救援的结果提供了进一步的证据,即使用BMG Labtech的Fluostar Omega可以用于高通量筛选。德赢vwin官网客服

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