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使用Flyostar Omega微孔板读卡器测量线粒体膜电位

Heather Mortiboys Oliver Bandmann 谢菲尔德学术神经病学 07/2008
  • 用烧血细胞测量的线粒体膜电位
  • 四甲基溴胺甲基酯流荧光直接与膜电位成比例
  • 在BMG Labtech的德赢vwin官网客服Fluostar上进行®欧米茄96和384井板格式

介绍

线粒体膜势的测量可用于各种研究区域,线粒体功能障碍涉及癌症,糖尿病,帕金森病和中风等疾病。德赢国际是真是假


在大多数真核细胞中,大多数ATP生产是通过呼吸链氧化磷酸化。以这种方式,糖类如葡萄糖和游离脂肪酸被氧化,导致在内部线粒体膜上泵送质子,产生电化学梯度(线粒体膜电位)。这反过来由呼吸链的复杂v用于产生ATP。因此,线粒体膜电位构成细胞的生物能量状态的大部分,并且根据细胞能量需求直接改变。例如,快速生长的肿瘤细胞具有比WT细胞更高的线粒体膜电位,并且静止静脉或分化细胞具有仍然较低的膜电位。


准确测量线粒体膜电位的能力可以给出关于线粒体的一般健康和功能的宝贵信息,特别是呼吸链的整体功能以及线粒体产生ATP的潜力,并为其他细胞组分提供能量。

这种潜力可以在这种潜力中的因素的数量是巨大的并且包括线粒体外的许多细胞组分,例如与蛋白酶体的活性相互作用。此外,细胞保持其线粒体膜电位的能力可能意味着细胞存活之间的差异,进入凋亡细胞死亡或坏死性细胞死亡过程。细胞还需要完整的线粒体膜电位进入细胞凋亡。通常使用非侵入性阳离子染料测量线粒体膜电位。将这些染料以与膜电位的直接成比例的量被隔离成线粒体基质,然后可以使用标准的流荧光技术测量,包括流荧光显微镜,流量读取器或使用微孔板读取器进行高通量测定。


德赢vwin官网客服BMG Labtech的Fluostar Omega酶标器用于高通量筛选测定测量人体细胞中的线粒体膜电位。此处呈现的结果使用来自对照的原代人烧血细胞获得。

材料与方法

  • 从Coriell Cell储存库获得的人体烧血细胞
  • 黑色96或384孔板,来自Greiner的透明底部
  • 四甲基溴胺甲酯(TMRM),Sigma
  • 羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP),Sigma
  • 乙锭同源过二聚体FL荧光染料,Invitrogen
  • Fluostar Omega microplate读卡器,BMG L德赢vwin官网客服abtech

在最小的生长培养基MEM中以10%FBS,100IU / ml青霉素,100μg/ mL链霉素,1mM丙酮酸,2mML-谷氨酰胺,0.1mM氨基酸,0.1mM氨基酸,0.1mM氨基酸,在最小的生长培养基MEM中以40%的生长培养基MEM镀以40%的生长培养基MEM。,50μg/ ml尿苷和1 x Mem维生素。


将24小时后细胞变成半乳糖培养基MEM(没有葡萄糖),如前所述,补充有10%FBS,100 u / ml青霉素,100μg/ ml链霉素和0.9mg / ml半乳糖。


在进一步24小时后,使用如前所述的Fl荧光染料四甲基吡喃胺甲酯(TMRM)测量线粒体膜电位。将Brie Fl y染料在50nm的测定缓冲液(80mM NaCl,75mM KCl,25mM D-葡萄糖,25mM HEPES,pH 7.4)中加载到细胞上,置于37℃的5分钟后,在PBS中洗涤4次并在FlyoStarω微孔板读卡器上测量(激发:544nm和发射:590nm,底部读数,每孔50°Fl)。


最初通过质膜将TMRM加载到电池中,随后将TMRM染料螯合到线粒体中,因为线粒体基质是细胞的最负荷部分。因此,血浆膜电位的变化可以在使用TMRM获得的结果中的影响。为了控制这一点,每个测定与上面并联进行加上10μm羰基氰化物3-氯苯基腙(CCCP),其塌陷线粒体膜电位。所有数据表达为总TMRM FOR荧光减去CCCP处理的TMRM FOR荧光。

重要的是要对细胞数进行量化和控制,特别是当在比较细胞系之间的结果时,因此在冷冻解冻后在平行板中使用1μm乙酸偶氮二聚体Fl荧光染料测量细胞数(激发:544nm和排放:645nm,底部每井读数50°)。

成绩与讨论

图1显示了在6个控制烧结细胞系中的线粒体膜电位,每次在单独的场合以三份测量并显示控制细胞系之间的变化缺乏变化。

图2显示用线粒体毒素'X'处理后相同控制烧成烧成烧结纤维蛋白的膜电位的降低72小时。这证明了测定敏感的范围,创造了一个大的“治疗窗口”。同样在该来的情况下,对照细胞已经用实验化合物'Y'处理,该实验化合物'Y'抵押通过用线粒体毒素'X'治疗引起的线粒体膜电位的降低。

图3显示,测定可以可靠地缩放到384孔板格式并获得稳健,可重新生产的结果。

结论

这些结果表明,Flyostarω适用于96和384孔板格式的线粒体膜电位。此外,具有线粒体毒素的健康对照烧结的延长低剂量处理导致线粒体膜电位的显着降低。


结果在许多不同的控制烧血线上可再现,并且使用实验化合物的这种缺陷的救援的结果提供了进一步的证据,即使用BMG Labtech的Fluostar Omega可以用于高通量筛选。德赢vwin官网客服

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