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膜流动性的紫外荧光偏振测量

Yulia Kushnareva (1) EJ Dell (2) (1)La Jolla过敏和免疫学研究所(2)BMG Labtech德赢vwin官网客服 12/2009
  • 通过荧光极化在脂质体和线粒体膜中测量膜流动性
  • DPH(1,6-二苯基-Hexa-1,3,5-三烯)用作FP测量的荧光染料
  • 测定地布卡因和普萘洛尔对膜流动性的影响

介绍

膜的流动性和脂类的其他性质通常使用各种荧光膜探针和荧光偏振(FP)测量来评估。其基本原理是,脂质堆积的改变(如温度依赖性脂质相变)改变了膜结合荧光团的迁移率。后一个参数(具体来说,“旋转弛豫”)可以通过用偏振光激励荧光团并在两个平面上测量发射的光——平行于和垂直于激发光的偏振面——来监测。FP定义为以下比率:I2- 一世/ 一世2• I,在那里我2和我分别在平行通道和垂直通道中测量荧光强度。


膜流态化增加染料的流动性并降低发射的平行组件的强度。因此,FP与膜的流动性成反比关系。荧光染料DPH的光学特性强烈地依赖于环境;染料在水溶液中几乎没有荧光,而结合到膜的疏水区域导致荧光信号的急剧增加(在紫外线范围内激发最大)。

本说明描述了使用德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器用于测量ph标记膜的脂质流动性的相对变化。

材料与方法

  • 来自Avanti极性脂质的磷脂
  • 大鼠肝脏线粒体分离
  • 壁挂式,透明的底部96孔板,来自剑杆轴
  • 来自BMG Labtech的酶标器,配备UV 德赢vwin官网客服FP光学

在脂质体和分离的线粒体中进行膜流动性测量。将100μl样品置于微孔板中。355 nm过滤器用于激励。发射在430nm处测量。


为了验证该方法,使用确定凝胶-液晶相变温度的脂质体进行FP测量。以1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰sn-甘油-3-磷酸胆碱(MPPC)为原料制备单片脂质体。这种脂质的转变温度在35 - 37℃范围内。为了荧光标记,MPPC脂质体与10µM DPH (Sigma)在45°C KCl-基缓冲液(150 mM KCl;10mm HEPES, pH 7.4;2毫米EGTA)。稳态FP测量在25 - 45°C。将酶标仪培养箱温度升高2℃,平衡10- 15min后进行FP测量。数据采集采用端点模式。


我们研究了一种更复杂的模型,即天然线粒体膜。离体大鼠肝线粒体(0.2 mg/ml)用10µM DPH室温预孵育40分钟。将酶标仪培养箱温度升高2℃,在每个给定温度下平衡10分钟,然后进行FP测量。这些实验中使用的线粒体处于失能(无呼吸)状态。最后,测定了膜活性药物地布卡因和心得安对脂质体和线粒体膜流动性的影响。


脂质体由以下模拟线粒体膜的脂质混合物形成:47%磷脂酰胆碱(PC)、28%磷脂酰乙醇胺(PE)、9%磷脂酰肌醇、9%磷脂酰丝氨酸(PS)和7%心磷脂(CL)。数据采集采用动力学模式。

成绩与讨论

如图1所示,从25℃升高到35℃并没有改变MPPC脂质体的FP值。这反映了脂类在此温度范围内所期望的高有序凝胶状态。当温度从35℃升高到39℃时,与相变相对应的FP值急剧大幅下降。在液相中,FP值随着温度升高至45℃继续下降。

与MPPC囊泡不同,在线粒体膜中没有观察到刚性(温度不敏感)状态或大规模的相转变(图2)。可以看到25-45℃温度范围内的FP逐渐减小,这与先前公布的DPH标记的DEENergized线粒体中的膜流动测量数据一致。还比较了整个线粒体和纯化的外部线粒体膜(OMM)中的相对FP值。两种膜系统中温度依赖性的模式相似,但OMM中的相对FP值显着高于全部线粒体(图2)中获得的相对FP值。与内部线粒体膜相比,该结果可以容易地通过ω中的较高的胆固醇水平解释。

最后,研究了丙唑啉和脱毛对脂质体和分离的线粒体的影响。根据浓度,这些药物可以增加膜流动性或刚性一些膜。图3显示,添加普萘洛尔至脂质体(图A)导致相对FP值的快速降低。在分离的线粒体(Panel B)中观察到类似的效果。与Dibucaine诱导的变化相比,FP的普萘洛尔诱导的FP降低,但仍然容易检测到。药物(40-80μm)的浓度与影响线粒体活性的浓度相同。数据表明,药物对线粒体功能的一些影响可能是由于膜流动性的增加。

结论

本研究证明了该方法的适用性德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器具有UV FP光学器件,用于测量基于微孔板的膜流动性。该方法允许监测膜流动性(例如相变)的大规模改变,以及脂质动态的更细微变化。该方法可以用作搜索改变脂质流动性的化合物中的高通量筛选测定。

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