205.

膜流动性测量使用UV荧光极化

Yulia Kushnareva(1)ej戴尔(2) (1)La Jolla过敏和免疫学研究所(2)BMG Labtech德赢vwin官网客服 12/2009
  • 通过荧光极化在脂质体和线粒体膜中测量膜流动性
  • DPH(1,6-二苯基-Hexa-1,3,5-三烯)用作FP测量的荧光染料
  • 测量Dibucaine和丙醇醇对膜流动性的影响

介绍

通常使用各种荧光膜探针和荧光极化(FP)测量来评估膜流动性和脂质的其他性质。基本原理是脂质包装中的改变(例如依赖于温度依赖性脂相转变)改变膜结合荧光团的迁移率。通过用偏振光激发荧光团并在两个平面中测量发射的光并垂直于激发光的偏振平面来监测后一参数(具体地,“旋转弛豫”)可以监测。FP定义为以下比例:iII- 一世/ 一世II+ I.,我在哪里II和我是在平行和垂直通道中测量的荧光强度。


膜流化增加染料的迁移率并降低发出的平行组分的强度。因此,FP与膜流动性相互作用。荧光染料DPH的光学特性强烈取决于环境;染料在水溶液中几乎是非荧光的,同时与膜的疏水区结合导致荧光信号的急剧增加(在UV范围内激发最大值)。

本说明描述了使用德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器用于测量DPH标记膜的脂质流动性相对变化的测量。

材料与方法

  • 来自Avanti极性脂质的磷脂
  • 从大鼠肝脏隔绝的线粒体
  • 壁挂式,透明的底部96孔板,来自剑杆轴
  • 来自BMG Labtech的酶标器,配备UV 德赢vwin官网客服FP光学

在脂质体和分离的线粒体中进行膜流动性测量。将100μl样品置于微孔板中。355 nm过滤器用于激励。发射在430nm处测量。


为了验证该方法,使用具有限定的凝胶到液晶相变温度的脂质体进行FP测量。Unilamellar脂质体由1- myristoyl-2-palmitoylsn-甘油-3-普膦啉(MPPC)制备。该脂质的过渡温度在35-37℃的范围内。对于荧光标记,在基于KCl的缓冲液(150mM KCl; 10mM HEPES,pH 7.4; 2mM EGTA)中,将MPPC脂质体在45℃下以45℃预孵育30分钟30分钟。稳态FP测量值在25-45°C。微孔板读卡器培养箱的温度增加了2℃,并且在将样品平衡10-15分钟后取出FP测量。数据在端点模式下获取。


研究了更复杂的模型,原生线粒体膜。分离的大鼠肝线粒体(0.2mg / ml)在室温下用10μmCPH预孵育40分钟。微孔板读卡器培养箱中的温度升高2℃,在对FP测量进行FP测量之前,在每个给定的温度下平均样品在每个给定的温度下平衡10分钟。在这些实验中使用的线粒体均处于脱硫(非呼吸)状态。最后,测定了膜活性药物Dibucaine和普萘洛尔对脂质体和线粒体膜流动性的影响。


脂质体由以下脂质混合物模仿线粒体膜形成:47%磷脂酰胆碱(PC),28%磷脂酰乙醇胺(PE),9%磷脂酰肌醇,9%磷脂酰丝氨酸(PS)和7%Cardiolipin(Cl)。数据以动态模式获取。

成绩与讨论

如图1所示,将温度从25〜35°C的增加不改变MPPC脂质体中的FP值。这反映了该温度范围内脂质的预期高排序凝胶状态。将温度从35到39°C增加导致与相位过渡对应的FP值的急剧性,大规模降低。在液相中,随着温度增加到45°C,FP值继续下降。

与MPPC囊泡不同,在线粒体膜中没有观察到刚性(温度不敏感)状态或大规模的相转变(图2)。可以看到25-45℃温度范围内的FP逐渐减小,这与先前公布的DPH标记的DEENergized线粒体中的膜流动测量数据一致。还比较了整个线粒体和纯化的外部线粒体膜(OMM)中的相对FP值。两种膜系统中温度依赖性的模式相似,但OMM中的相对FP值显着高于全部线粒体(图2)中获得的相对FP值。与内部线粒体膜相比,该结果可以容易地通过ω中的较高的胆固醇水平解释。

最后,研究了丙唑啉和脱毛对脂质体和分离的线粒体的影响。根据浓度,这些药物可以增加膜流动性或刚性一些膜。图3显示,添加普萘洛尔至脂质体(图A)导致相对FP值的快速降低。在分离的线粒体(Panel B)中观察到类似的效果。与Dibucaine诱导的变化相比,FP的普萘洛尔诱导的FP降低,但仍然容易检测到。药物(40-80μm)的浓度与影响线粒体活性的浓度相同。数据表明,药物对线粒体功能的一些影响可能是由于膜流动性的增加。

结论

这项研究表明了这种适用性德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器具有UV FP光学器件,用于测量基于微孔板的膜流动性。该方法允许监测膜流动性(例如相变)的大规模改变,以及脂质动态的更细微变化。该方法可以用作搜索改变脂质流动性的化合物中的高通量筛选测定。

对你也有趣

去顶级