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BCA浓度测定方法的小型化和处理量的提高

卡尔•彼得斯 德赢vwin官网客服美国BMG LABTECH 05/2018
  • 由于低体积中固有的短路长度,所以成功的吸光度测定小型化部分是有限的
  • 本实验利用了白色微孔板的荧光特性
  • 在1536孔板中,只需1.5µl的样品和7.5µl的试剂即可

介绍

测定总蛋白浓度是一种公认的比较和标准化生物样品的方法。蛋白质浓度评估的应用扩展到高通量筛选平台,包括蛋白质组学和基因组学应用。理想情况下,蛋白质浓度测定也应符合高通量。大多数蛋白质测定法使用吸光度法检测,这是很难最小化的高通量。此前,有报道称,比色法,包括双喹啉酸(BCA)蛋白测定,可以在白色平板上使用荧光检测1,2。该方法利用了白色平板固有的荧光特性。在吸收溶液存在的情况下,固有的荧光是淬灭的,荧光信号的减少可以用来测量比色法测定。


测定原则

这里描述的ePI吸光度方法依赖于白色板表现出的荧光特性,使得当〜435nm的激发光在板上闪烁时,可以观察到约〜560nm的发射信号(图1)。比色试剂/产品吸收光并抑制可以检测的流量信号。比色产品的进一步发展导致检测到的流动荧光信号的进一步降低。

材料与方法

  • 皮尔斯TMBCA蛋白质测定试剂盒和预稀释蛋白质标准:牛血清白蛋白(BSA)设定(Thermo Scienti Fi C)
  • 白色,低体积384孔板(格赖纳/康宁)
  • 白色,1536孔板(Labcyte)
  • Clariostar.®微孔板读卡器(BMG Labtech)德赢vwin官网客服

光谱扫描
将空孔和含有制备好的BCA试剂的孔分别加入或不加入不同浓度的BSA。这些是用CLARIOstar扫描的,设置如下:

励磁扫描 排放扫描
激发波长[nm] 374 - > 534 417.
激发带宽(nm) 10 16
发射波长(nm) 562. 445 - > 630
发射带宽(nm) 16 10
GAIN(GREINER 384) 1599 1254
获得(康宁384) 1506. 1416.
收益(Labcyte 1536) 1290 996.

BCA荧光检测法
在培养皿中加入不同浓度的BSA。384孔板体积为2 μl, 1536孔板体积为1.5 μl。随后加入制备好的BCA试剂。384个孔板采用10 μl, 1536个孔板采用7.5 μl。克拉罗星上的铭牌的设置如下所示。

励磁 435 - 15
二向色 497.2
发射 562 - 20
增益(康宁) 1758年
获得(格林尼) 1729
获得(Labcyte) 1407.

将数据转换为使用线性回归来实现分析。

F =荧光,F0=缓冲空白


成绩与讨论

两个低体积384孔板(Greiner和Corning)和1536孔板(Labcyte)的比较显示了每个板的相似光谱,其在435-450(图2A)和范围内的发射最大值460-510(图2b)。

BCA试剂降低了荧光激发峰和发射峰。随着显色后蛋白质浓度的增加,观察到进一步的降低(图3)。

基于该光谱数据Clariostar LVF单色仪TM设置为435-15的激发和562-20的发射和线性变量二色自动调整到497.2读取重复的各种浓度的BSA (125-2000 mg/mL)。利用荧光测量建立转换后的标准曲线,曲线图显示,384孔板中的12 μl (2 μl蛋白质)样品与1536孔板中的9 μl (1.5 μl蛋白质)样品符合线性拟合(图4)。

结论

我们的研究结果表明,EPI吸收方法可以成功地小型化BCA测定。报告了第一个定时小型化到1536孔板。可以达到试剂体积和样品体积的显着节省。虽然每个板的光谱特性略有不同,但这些差异并没有让我们能够实现直接比较,这表明所有测试所测试的所有板在转换为OD之间的良好线性相关性562.和BSA浓度。


参考资料

1.Zuck PI, O 'Donnell GT, Cassady J, Chase P, Hodder P, Strulovci B, Ferrer M(2005)利用白色微孔板的荧光特性进行吸光度测定的小型化。肛门生化342 254-259
2. Bainor AI,Chang L,McQuade TJ,Webb B,Gestwicki Je,(2010)低体积肛门Biochem 410 310-312中的双子挑旋(BCA)测定

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