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小型化和改善BCA浓度测定方法的产量

卡尔彼得斯 德赢vwin官网客服BMG Labtech,USA 05/2018
  • 由于低体积中固有的短路长度,所以成功的吸光度测定小型化部分是有限的
  • 在该ePI吸收速度读出读出时,白微微孔板​​的流出性质被利用
  • 只需1.5μL样品,7.5μl试剂可用于1536孔板中

介绍

确定总蛋白质浓度是可接受的比较和标准化生物样品的手段。蛋白质浓度评估的效用延伸到高通量筛选平台,包括蛋白质组学和基因组应用。理想情况下,蛋白质浓度测定也应适用于高通量。大多数蛋白质测定测定使用吸光度测量检测,这是难以最大限度地降低吞吐量的困难。以前,据报道,使用FOOREGENT检测,可以在白色的白板中进行比色测定,包括双碳酸(BCA)蛋白质测定法1,2。该方法利用白板的固有流荧光。在存在吸收溶液中,淬火固有的流荧光,并且可以使用荧光信号的降低来测量比色测定。


测定原则

这里描述的ePI吸光度方法依赖于白色板表现出的荧光特性,使得当〜435nm的激发光在板上闪烁时,可以观察到约〜560nm的发射信号(图1)。比色试剂/产品吸收光并抑制可以检测的流量信号。比色产品的进一步发展导致检测到的流动荧光信号的进一步降低。

材料与方法

  • 刺穿TM值BCA蛋白质测定试剂盒和预稀释蛋白质标准:牛血清白蛋白(BSA)设定(Thermo Scienti Fi C)
  • 白色,低卷384孔板(Greiner / Corning)
  • 白色,1536孔板(Labcyte)
  • Clariostar.®微孔板读卡器(BMG Labtech)德赢vwin官网客服

光谱扫描
向每个板型中加入含有或不具有变化的BSA的BCA试剂的空孔和孔。使用以下设置将这些与Clariostar一起扫描:

励磁扫描 排放扫描
激发波长[nm] 374 - > 534 417.
励磁带宽[nm] 10. 16.
发射波长[nm] 562. 445 - > 630
发射带宽[nm] 16. 10.
GAIN(GREINER 384) 1599 1254.
增益(康宁384) 1506. 1416.
收益(Labcyte 1536) 1290. 996.

BCA测定的荧光检测
将每个BSA浓度的重复加入到板上。使用2μL的体积384孔板,并且使用1.5μl的体积1536孔板。随后加入制备的BCA试剂。在384个孔板中使用量为10μL,在1536孔板中使用7.5μL。在Clariostar上读取板,在下面指出的设置。

励磁 435 - 15.
二向色 497.2
排放 562 - 20
增益(康宁) 1758年
收益(Greiner) 1729.
增益(Labcyte) 1407.

将数据转换为使用线性回归来实现分析。

f =荧光,f0.=缓冲空白


成绩与讨论

两个低体积384孔板(Greiner和Corning)和1536孔板(Labcyte)的比较显示了每个板的相似光谱,其在435-450(图2A)和范围内的发射最大值460-510(图2b)。

BCA试剂减少,荧光激发和发射峰。在显色后蛋白质浓度的存在下观察到进一步减少(图3)。

基于该光谱数据Clariostar LVF单色仪TM值被设定为435-15次激发,发射562-20,直线可变二色性自动调节至497.2,以读取各种浓度的BSA(125-2000mg / ml)的重复。FOR荧光测量用于产生转化的标准曲线,当图表显示384孔板中的12μl(2μl蛋白)样品符合1536孔板中的9μL(1.5μL蛋白)样品的线性滤芯。(图4)。

结论

我们的研究结果表明,EPI吸收方法可以成功地小型化BCA测定。报告了第一个定时小型化到1536孔板。可以达到试剂体积和样品体积的显着节省。虽然每个板的光谱特性略有不同,但这些差异并没有让我们能够实现直接比较,这表明所有测试所测试的所有板在转换为OD之间的良好线性相关性562.和BSA浓度。


参考

1. ZUCK PI,O'Donnell GT,CASSADY J,CHASE P,HODED P,Strulovci B,Ferrer M(2005)使用白色微孔板的流动性能的吸光度测定小型化。肛门Biochem 342 254-259
2. Bainor AI,Chang L,McQuade TJ,Webb B,Gestwicki Je,(2010)低体积肛门Biochem 410 310-312中的双子挑旋(BCA)测定

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