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使用回波液处理器和Pherastar FS的细胞基TNF-ααα分析的小型化

Carl Peters(1)Bonnie Edwards(2) (1)B德赢vwin官网客服MG Labtech(2)Labcyte 12/2014
  • 在1536孔微孔板中可以将α-孔的分析小型至2μl
  • TNF-α在刺激的THP-1细胞中检测到拮抗剂效力

表的内容

介绍

肿瘤坏死因子(TNF)-α主要由巨噬细胞和单核细胞分泌,在那里它在免疫系统的几种功能中起重要作用,例如炎症和细胞死亡。然而,TNF-α的过度生产已与炎性疾病(如类风湿性关节炎)有关。因此,筛选TNF-α生产的潜在抑制剂可能导致炎症性疾病的有益处理。


用于筛选目的的小型化提出了一种有吸引力的情景,其中可以进行药物发现,同时节省目标化合物和检测试剂的支出。对于测定的小型化成功液体必须以极度精度处理,小体积需要高度敏感的检测。在这里,我们描述了Pherastar的使用®FS.从BMG 德赢vwin官网客服Labtech检测一个字母®被回声小型化的测定®液体处理程序从labcyte。

测定原理

TNF-αalphalisa®免疫测定使用针对供体和受体珠的分析物(TNF-α)特异的抗体。如果分析物存在,则供体和受体珠子将通过它们的抗体与分析物结合。将供体和受体珠子带入接近,使得在680nm的激光激发之后可以检测到615nm处的发射信号。


回声®Labcyte的液体处理器采用声能以精度和准确度以纳升体积增量转移液体。转移是平台,消除了携带的风险,同时提供额外的成本节约。


Pherastar中可用的激光激励和测定特定光学模块FS.微孔板阅读器提高AlphaLISA分析的性能。


材料与方法

  • alphalisa.®人类TNF-α研究免疫测定套件(PerkinElmer)
  • THP-1细胞(ATCC)
  • ( - ) - 盐酸异丙醇,沙丁胺醇,组胺二盐酸和脂多糖(LPS)都是从Sigma获得的
  • 回声555液体处理器和384孔回声合格源微孔板(Labcyte)
  • 1536孔白色,固体底部测定微孔板(Labcyte)
  • Pherastar.FS.微孔板读卡器(BMG Labtech)德赢vwin官网客服

在所有的实验中,液体都是使用Echo加入的®除非另有说明,否则液体处理程序。在每个转移步骤之后,在密封板或盖板之前完成短暂的离心(1秒/ 1000 rpm)。


TNF-α标准稀释系列
进行初始小型化实验以确保检测已知量的分析物的能力。为了完成该1.6ml分析物,然后加入200nL含有受体珠粒和抗TNF-α抗体的混合物。在室温下孵育1小时,在黑暗的200nl供体珠中加入终体积为2ml。在Pherastar上读取较额外30分钟的室温孵育深板后FS.

TNF-α在THP-1细胞中产生
随后的实验试图评估通过THP-1细胞检测TNF-α产生的能力,以及各种化合物对TNF-α的产生的影响。将前5个化合物转移到平板中。然后使用多重方法将3000个细胞分配1.5mLTM值Combi,然后添加95 NL的LPS。在37℃温育3小时后,加入2001℃的受体珠/抗TNF-α抗体。在室温下孵育1小时后,加入200nl的供体珠,最终体积为2mL。在Pherastar上阅读额外30分钟的室温培养板后FS.


对于两个实验板,使用以下设置读取板:

测量类型: AlphaScreen®
阅读模式: 终点
光学模块: alphalisa.®
激发波长: 680 nm.
发射波长: 615 nm.
定位延迟(秒): 0.1
激发时间(秒): 0.30
集成开始(SEC): 0.34
集成时间(SEC): 0.60
获得: 3600

结果与讨论

测试了几倍稀释的TNF-a,以确认回声液处理器准确分配AlphaLISA试剂和pherstar的能力FS.敏感地检测2mL测定(图1)。

图1中的结果表明,在低至2 μl的测定量中,TNF-α在高背景信号和灵敏度的浓度范围内被检测到。图2显示了在低分析物浓度下获得的高线性。

由于在Alpha技术中使用供体和受体珠子,因此研究了该alphalisa测定中是否存在任何可变性。1小时后没有显着的变异性,表明源板中的珠子沉降不是问题(未显示的数据)。


THP-1细胞是一种人类单核细胞,其特征是在LPS治疗后能够产生TNF-α。前期研究结果表明-肾上腺素能受体和组胺H2受体激动剂对脂多糖诱导单核细胞TNF-α具有抑制作用。该微型试验的结果与预测结果一致(图3)。

用LPS治疗表现出大于3倍的信号,同时与β肾上腺素能受体激动剂共同处理导致该增加的抑制大于50%。用组胺治疗具有更温度的效果(5%抑制)。


结论

使用Labcyte和BMG LABTECH技术成功实现了TNF-α α α α含量的微型化。德赢vwin官网客服能够小型化这些分析,从而减少试剂的使用高达25倍,可以提供显著的成本节约,以及减少化合物和样品/细胞的使用。

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